山东省外观健康羊群中检出羊边界病病毒

彭 程，王素春，庄青叶，侯广宇，黄 娟，单 虎，陈继明

（1.青岛农业大学，山东青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

山东省外观健康羊群中检出羊边界病病毒

彭 程1，2，王素春2，庄青叶2，侯广宇2，黄 娟1，单 虎1，陈继明2

（1.青岛农业大学，山东青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

2014年从山东省外观健康的牛羊采集鼻拭子样品共707份，提取其RNA，用流感病毒特异性引物进行RT-PCR检测。对RT-PCR扩增的阳性产物进行序列测定，意外发现其中1份羊拭子样品含有羊边界病病毒，并且该结果得到其他试验验证。结合我国2012年首次在安徽和江苏两地检出该病毒，以及当前我国羊群流通情况，推测该病毒可能在我国有所存在。该调研结果对分析各类RT-PCR检测的假阳性产生原因，有参考意义。并提示RT-PCR检测结果难以作为疫病或感染病诊断的确切依据。其诊断结果有时需要用荧光探针或测序进行进一步鉴定。

边界病病毒；羊；RT-PCR；系统进化；假阳性；山东

边界病（border disease，BD）是由黄病毒科瘟病毒属的边界病病毒（BDV）引起的以绵羊为主的慢性进行性传染病[1]。该病主要侵害羊胎和羔羊，以新生羔羊骨骼肌震颤和被毛异常为主要特征。BDV还可感染山羊、牛、其他反刍动物和猪。

目前，许多国家和地区已发现BDV的存在。2012年，我国首次在安徽和江苏发生腹泻的羊场中检测到BDV[2-4]。2014年，我们在进行牛、羊的流感病毒检测时，意外地从山东省外观健康羊群中检出BDV，我们对此结果进行了深入分析，报道如下。

1 材料和方法

1.1 样品采集

采集来自山东平度和莱西共15个牛场和10个羊场健康牛、羊的鼻腔黏液。根据养殖场规模大小，每场随机采集样品20-40份。牛鼻腔拭子样品450份，羊鼻腔拭子样品257份，合计707份。拭子置于含10%甘油和抗生素的PBS保存液中，冷藏下运至实验室。

1.2 RNA提取

将拭子样品10000 r/min离心10 min，取200μL上清液，用QIAxtractor高通量核酸提取仪及其配套试剂盒cador®Pathogen 96 QIAcube®HT Kit（德国QIAGEN公司）提取病毒RNA。

1.3 流感病毒RT-PCR检测

根据GenBank上已发表的丙型流感病毒基因序列作为参考序列，设计并合成检测丙型流感病毒的保守性引物（表1）。用该引物和Takara Prime-ScriptTM One Step RT-PCR试剂盒对所提取RNA进行RT-PCR检测。检测反应条件见表1。扩增产物用QIAxcel advanced全自动实时毛细管电泳仪（德国QIAGEN公司）进行毛细管电泳。

1.4 克隆测序

阳性RT-PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶上电泳后，进行回收纯化，再连接至pMD-19T载体，进行克隆测序。

表1 本研究所用的三个RT-PCR检测方法

图1 测出的BDV核酸序列系统分析结果

1.5 序列同源性和遗传进化分析

测序结果用BLAST进行比对。用MEGA 5.0软件进行核苷酸最佳变异模式的计算，再按照此最佳变异模式，即贝叶斯信息标准值（Bayesian Information Criterion）最小的模式，进行系统进化分析。

1.6 BDV进一步确认

用BDV两个特异性RT-PCR反应（表1），对相应的阳性检测结果进行复核，此复核RT-PCR阳性检测结果也进行序列测定和BLAST比对分析。

2 结果

2.1 样品RT-PCR检测

将RT-PCR产物进行实时毛细管电泳，25个牛、羊养殖场的共707份样品中，有22个样品在目的条带（约为619bp）附近出现疑似阳性条带。其中，牛、羊拭子样品各11个。

2.2 序列分析

将克隆测序结果进行BLAST比对，发现牛拭子阳性样品RT-PCR扩增的序列为流感病毒序列，并且该流感病毒与美国2013年首次发现的牛流感病毒高度同源，已另文发表[5]；而羊拭子阳性样品扩增产物的序列与BDV的序列高度同源。该序列已经提交GenBank（收录号为：KP091736）。 用 Mega软件进行遗传进化分析，进一步确认该序列为BDV序列（图1），说明该RT-PCR扩增产物对应的一份绵羊拭子样品中含有BDV。

2.3 阳性结果复核

通过上述试验发现的BDV阳性绵羊鼻拭子样品，用BDV两个特异性RT-PCR检测方法进行复核检测，结果全为阳性（图2）。对这两个阳性扩增产物的核酸序列，经

BLAST比对，全为BDV的序列。这进一步验证了这个绵羊鼻拭子样品确实含有BDV。

图2 BDV两个特异性RT-PCR检测结果

3 讨论

2012年，我国首次从安徽和江苏两地羊群中检出BDV[2-4]。本次调研又意外地首次从我国山东省检出BDV。因此，我们推测BDV可能在我国有所存在，这与BDV在国际上分布广泛[1]，也是一致的。我国2014年在羊的小反刍兽疫疫情流行病学调查时，发现我国活羊（尤其是羊羔）跨省运输频繁，可能有助于BDV在我国跨省传播。此外，该病毒可引起持续性感染，并且既可以水平传播，也可以垂直传播，这些都有利于该病毒扩大其地理分布范围。

本文用流感病毒的引物对707份样品进行检测，只检测到1份BDV阳性；但由于该引物与BDV匹配性较差，该结果并不表明这707份样品中只有1个BDV阳性。

RT-PCR是动物疫病诊断、检测、监测常用的方法。同其他方法一样，该方法也会产生假阳性结果。以往人们常常仅关注RT-PCR假阳性结果出现概率或如何降低这种概率，未曾深入分析为何出现假阳性。我们这次调研意外检出BDV，正是流感病毒RT-PCR检测的一个假阳性结果。我们通过序列比较，分析这个假阳性结果源自流感病毒RTPCR所用的下游引物独自引起了这个假阳性结果。该引物的3’端与BDV一段序列略有互补（仅有4至5个核苷酸互补），从而导致在42℃下反转录时，对BDV的RNA序列进行反转录，而该引物的3’端还与BDV序列中一段序列比较相似（有5到9个核苷酸相同），并且位于上述BDV的RNA序列反转录起始位点的上游约600个核苷酸处。这是产生这种假阳性结果的原因。在GenBank数据库中进行BLAST分析时，不能发现该引物与BDV核酸序列同源，因此这种假阳性情况在引物设计时无法预先避免，并且即便通过调整序列避免了这种非特异性扩增，却有可能引起对其他基因的非特异性扩增。因此， RT-PCR检测结果难以作为疫病或感染病诊断的确切依据。其诊断结果有时需要用荧光探针或测序进行进一步鉴定。

[1]朱其太.边界病的研究进展[J].甘肃畜牧兽医，1998（4）：32-34.

[2]李文良，毛立，赵永前，等.江苏部分地区羊群边界病流行情况调查[J].中国兽医学报，2013，33（12）：1808-1812.

[3] Li W，Mao L，Zhao Y，et al. Detection of border disease virus（BDV）in goat herds suffering diarrhea in eastern China [J]. Virology Journal，2013，10：80.

[4] Liu X，Mao L，Li W，et al. Genome Sequence of Border Disease Virus Strain JSLS12-01，Isolated from Sheep in China [J]. Genome Announc，2013，1（6）：e00502-13.

[5] Jiang WM，Wang SC，Peng C，et al. Identification of a potential novel type of influenza virus in bovine in China [J]. Virus Genes，2014，49（3）：493-496.

Detection of Border Disease Virus（BDV）in Apparently Healthy Sheep in Shandong

Peng Cheng1，2，Wang Suchun2，Zhuang Qingye2，Hou Gaungyu2，Huang Juan1，Shan Hu1，Chen Jiming2
（1.Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109；2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

707 nasal swab samples were collected from apparently healthy cattle and sheep in Shandong province in 2014. RNA was extracted from these samples and detected by RT-PCR using the primers specific to influenza viruses. RT-PCR products of the positive samples were sequenced. Unexpectedly，border disease virus（BDV）was found in one sheep swab sample，which was further confirmed through two RT-PCR assays specific to BDV. It was assumed that BDV likely exist in China，for BDV had been detected in Anhui and Jiangsu provinces in 2012 and live sheep were in frequent movement. The result was also of reference for the analysis of false positive results in various RT-PCR assays. It was suggested that the RT-PCR results hardly provide exact evidences for disease or infection diagnosis. The diagnosis results should be further identified by fluorescence probe or sequencing sometimes.

border disease virus；sheep；RT-PCR；evolution；false positive；Shandong

S852.654

A

1005-944X（2015）03-0001-03

陈继明，单 虎