宁夏地区奶牛隐性乳房炎主要病原菌分离鉴定及药敏试验

吴亚文，李志红，杨佳冰，张玉玲，李莉娟，安泓霏，王玉梅，王晓亮，张和平，张学军，王磊

（宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏银川 750011）

宁夏地区奶牛隐性乳房炎主要病原菌分离鉴定及药敏试验

吴亚文，李志红，杨佳冰，张玉玲，李莉娟，安泓霏，王玉梅，王晓亮，张和平，张学军，王磊

（宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏银川 750011）

[目的]了解宁夏地区奶牛隐性乳房炎主要病原菌流行情况及主要病原菌的耐药特征。[方法]采集宁夏地区5个规模化奶牛养殖场乳样共计461份，分离培养后，应用全自动细菌鉴定仪进行鉴定并选择主要致病菌进行药敏试验。[结果]隐性乳房炎阳性检出率平均为65.3%（301/461）；分离到金黄色葡萄球菌22株、无乳链球菌5株、大肠杆菌10株。这些细菌对阿米卡星、头孢噻肟等药物敏感，对青霉素与环丙沙星耐药。[结论]宁夏地区奶牛隐性乳房炎的阳性率较高，主要病原菌对阿米卡星、头孢噻肟等药物敏感。

奶牛；隐性乳房炎；病原菌；分离；鉴定；药敏试验

奶牛乳房炎为奶牛的常见病和多发病，是一种对乳业影响最大、危害最严重的常见疾病，严重影响奶牛养殖业的健康发展和生鲜乳质量安全。引起奶牛乳房炎的病原微生物包括细菌、真菌、霉形体、酵母菌、病毒等80多种，也有报道称多达150多种[1-2]。主要病原菌包括金黄色葡萄球菌（SA）、无乳链球菌（SAG）、大肠杆菌（CO）、其他链球菌（OS，或环境性链球菌ES）等；次要病原菌包括凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）、牛棒状杆菌（CB）及其他细菌（OTH）等[2-5]。尽管奶牛规模化养殖越来越大，管理越来越规范，奶牛各种疾病，尤其是乳房炎发病率已成下降趋势，但在一些中、小规模牛场和建场比较早的一些牛场，奶牛乳房炎，尤其是隐性乳房炎的发病率依然居高不下。临床发现

的奶牛乳房炎多为隐性病例，多数临床性乳房炎病例都是由隐性病例发展而来。由于隐性乳房炎造成不易察觉的产奶量隐性损失，常被忽视，且极易转为临床型乳房炎，带来更大的损失。因此，及时了解和掌握引起宁夏地区奶牛乳房炎发病的病原微生物的流行病学特点，对预防和治疗隐性乳房炎有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 待检材料

以宁夏地区5个规模化奶牛养殖场泌乳奶牛（饲养规模均为500-600头）为调查和研究对象，5个牛场分别采集非临床性乳房炎乳样118份、89份、89份、100份和65份。

1.2 试验动物

ICR清洁级小鼠84只，体重约18-25g，购于宁夏医科大学实验动物中心。

无菌采集乳样（每头牛四个乳区乳样混合），样品采集后标明耳标号、日期，将取样试管放在试管架上，放置装有冰块的便携式冷藏箱中尽快送往实验室。

1.4 仪器与设备

无菌操作台、恒温培养箱、全自动细菌鉴定仪（美国BD公司生产，型号为BD2011）等。

1.5 材料与试剂

5%绵羊血液琼脂（购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）；Baird Parker培养基、伊红美蓝琼脂、营养肉汤、革兰氏染液、3%过氧化氢及1∶4兔血浆（1ml兔血浆加入3ml灭菌生理盐水）（宁夏动物疾病预防控制中心实验室自制）；BD鉴定肉汤管、BD药敏肉汤管、BD药敏指示剂、BD链球菌药敏指示剂、BD革兰氏阳性菌、阴性菌与链球菌鉴定药敏符合板（购自北京兰伯瑞生物技术有限公司）。

1.6 细菌的分离与纯化

将乳样分别用无菌涂抹棒涂布于5%绵羊血液琼脂、BP培养基、伊红美蓝琼脂的1/2区域上，3个平行。放入37℃温箱内培养24～48h，观察菌落形态，挑取单个菌落涂片、革兰氏染色并镜检，初步判定染色特性和形状。

1.7 动物接种试验

周岱翰曾治疗过两个同时查出肝癌的患者。其中一个到美国进行肝移植，另一个由他进行中药调理。半年后，两人在美国见面。肝移植的病人大哭不止，因为移植后他几乎被完全监护，开口怕吃错，动手怕做错，过得生不如死。而另一个病人在感觉症状减轻后便携妻子周游世界。288天后，肝移植病人在痛苦中死去了。虽然另一人一年后也过世了，但在他生命最后的日子里，活得很滋润，走得没有遗憾。

为了减少下一实验环节需要鉴定细菌的数量，进行动物接种试验，选择有致病力的细菌进行鉴定。用灭菌注射器吸取上述各种纯化菌株的37℃ 24h肉汤培养物，腹腔注射健康小鼠，每只0.5ml，实验组每种菌接种3只小鼠。随机选取3只小白鼠，腹腔注射无菌肉汤0.5ml作为对照。观察2d左右，记录结果。

1.8 细菌的鉴定与药敏试验

结合上述动物接种实验结果，挑取能使小白鼠发病的细菌纯培养的菌落（同类型的主要病原菌每种选5株）接种于细菌鉴定仪的细菌鉴定药敏复合板上，进行鉴定，随后进行药敏试验。革兰氏阳性菌接种于革兰氏阳性菌鉴定药敏复合板、革兰氏阴性菌接种于革兰氏阴性菌鉴定药敏复合板，链球菌接种于链球菌鉴定药敏复合板。培养37℃ 10～12 h后，读取全自动细菌仪上的结果。

由于鉴定仪不能详细地区分葡萄球菌属的各种细菌，要进一步在Baird Parker培养基上培养葡萄球菌，观察菌落形态特征，通过进行接触酶试验及血浆凝固酶试验鉴定细菌的种类。

2 结果与分析

2.1 细菌分离与纯化

乳样初培养后，24h观察一次，48h再观察一次。5个奶牛场乳样病原菌检出率培养结果统计见表1。细菌染色、镜检可见细菌既有革兰氏阳性菌又有革兰氏阴性菌，可见葡萄串样细菌、杆状细菌和链状细菌。

表1 5个牛场乳样中隐性乳房炎病原菌检出率

2.2 动物试验

小鼠接种后，有56只在24～48h内均表现不同程度的发病症状，并开始死亡，其他小鼠仅表现短期精神沉郁。剖检发病及死亡小鼠，多见肺淤血，肝脏被膜有出血点，肠管浆膜出血、臌气等病理现象。做病变器官的组织触片、染色镜检，均可见与相应接种菌形态相似、染色特性一致的细菌。对照组3只小白鼠精神状态良好，无异常症状。

2.3 细菌鉴定

2.3.1 乳样中病原菌的分离率。结合仪器鉴定结果，随后对葡萄球菌属的细菌进行进一步的鉴定。在Baird Parker培养基形成圆形、隆起、灰色或黑色周围带沉淀线的菌落且接触酶试验阳性、血浆凝固酶试验阳性的细菌，鉴定为金黄色葡萄球菌；血浆凝固酶试验阴性的细菌，鉴定为凝固酶葡萄球菌。5个奶牛场乳样中病原菌的鉴定情况分别见表2。

2.3.2 乳样中的主要病原菌。动物试验中使小鼠表现出临床症状及死亡的细菌说明其有一定的致病性，按照临床经验作为主要病原菌单独列表如下（表3）。

表3 5个牛场乳样中主要病原菌分离鉴定结果

通过5个奶牛场461份乳样细菌培养分离鉴定的情况分析，本次调查中引起宁夏地区奶牛隐性乳房炎主要病原菌是金黄色葡萄球菌、无乳链球菌（73%），低于郭海勇报道主要病原菌占细菌总数83.33%[6]。金黄色葡萄球菌是优势菌，与相关报道一致。这种状况必然会导致我区生鲜乳体细胞计数、细菌计数水平升高，生鲜乳质量安全隐患较大。

2.4 药敏试验的结果

通过对全自动细菌仪药敏结果统计得知：金黄色葡萄球菌对阿米卡星、头孢噻肟、庆大霉素与复方磺胺敏感，对青霉素与环丙沙星耐药；无乳链球菌对阿米卡星、头孢噻肟、头孢吡肟、阿莫西林药物敏感，对克林霉素、氯霉素与四环素耐药；大肠杆菌对阿米卡星与头孢噻肟敏感，对头孢唑啉、氨苄西林耐药。

3 讨论与小结

5个牛场奶牛隐性乳房炎主要病原菌中金黄色葡萄球菌分离率相对较高。金黄色葡萄球菌是定植于乳腺的传染性病原微生物，较难防治。切断传播途径是防止本病发生的有效措施，如挤奶器的消毒，挤奶人员卫生意识的提高等。大肠杆菌，无乳链球菌是环境性病原微生物，这类病原菌常寄生在牛体表及周围环境中。因此，搞好奶牛场的饲养管理，环境消毒，牛舍、牛床地面的清洁，粪便的及时处理，挤奶卫生等措施尤为重要。在夏季时，应注意消灭蚊蝇，保持牛体清洁，牛舍通风，以减少或避免大规模发生乳房炎。

5个规模化奶牛场奶牛病原菌感染率平均达65.3%，与郭海勇报道感染率为65.63%基本一致[6]，普遍高于奶业发达国家牛群乳房炎50%的防控指标，稍高于刘东军报道的62.7%[7]；检出了各牛场隐性传染性乳房炎感染牛，特别是危害较大的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌感染牛，金黄色葡萄球菌平均分离率为4.8%，有2个牛场即1场和2场金黄色葡萄球菌分离率达6.7%以上，接近于日本牛

群金黄色葡萄球菌乳房炎7%的防控指标。从细菌的分离率结果可知凝固酶阴性葡萄球菌（53.4%）、金黄色葡萄球菌（4.8%）、牛棒状杆菌（4.6%）、其他链球菌（3.0%）、大肠杆菌（2.2%）、无乳链球菌（1.1%、）其他细菌（1.3%）分别依次为我区奶牛乳房炎常见致病菌。凝固酶阴性葡萄球、牛棒状杆菌的高检出率表明我区挤奶程序、挤奶技术和挤奶卫生消毒管理还不够规范。虽说是次要病原菌，但也应引起养殖户的高度重视，以免导致更多临床型乳房炎的发生。

主要致病菌进行药敏试验，结果表明细菌对青霉素、环丙沙星已产生耐药性；对阿米卡星、头孢噻肟药物敏感，建议临床可以使用。不同地区奶牛乳房炎病原菌对抗生素的敏感性呈现较大的差异，除了血清型的地区性差异这一原因外，抗生素的大量使用也是细菌产生抗药性差异的直接原因，应引起各奶牛场的足够重视。

因此，牛场应采取措施提高奶牛免疫力，强化挤乳卫生要求，提高饲养管理和环境卫生标准，以减少健康牛发生隐性乳房炎；选择有效的预防和治疗药物防止隐性乳房炎转为临床型乳房炎，从而避免重大经济损失的出现，仍然是奶牛乳房炎防控的要点。

[1]魏小娟，蒲万霞，周绪正，等.兰州地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].动物医学进展，2007，28（8）：113-114.

[2]乌伦吉如嘎，郭志凯，邓常胜，等.奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].畜牧与饲料科学，2012，33（10）：114-115.

[3]邓海平，俞诗源，王玲，等.内蒙古地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验研究[J].安徽农业科学，2009，37（2）：595-596+598.

[4]张珠明，汪仁莉，何生虎.吴忠市奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].现代农业科技，2009，（17）：307-308.

[5]张中文，吴国娟，刘凤华，等.北京地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].北京农学院学报，2002，17（4）：42-47.

[6]郭海勇，韩国华，崔京春.大连地区奶牛隐性乳房炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医，2011，38（9）：163-166.

[7]刘东军.新疆石河子地区隐形乳房炎病原菌的分离鉴定和药敏试验[J].广东畜牧兽医科技，2009，34（4）：22-23.

Isolation and Identifi cation of Subclinical Mastitis Pathogens and Drug Sensitivity Tests in Dairy Cows in Ningxia Autonomous Region

Wu Yawen，Li Zhihong，Yang Jiabing，Zhang Yuling，Li Lijuan，An Hongfei，Wang Yumei，Wang Xiaoliang，Zhang Heping，Zhang Xuejun，Wang Lei
（Ningxia Center for Animal Disease Control and Prevention，Yinchuan，Ningxia 750011）

[Objective] To clarify the species and distribution of cow sub-mastitis pathogens in Ningxia Hui Autonomous Region and identify the antimicrobial resistance of the main pathogens. [Method] 461 milk samples were collected from dairy cows with subclinical mastitis in five dairy farms for isolation and identification of pathogenic bacteria. Identification and drug sensitivity tests of the prominent pathogens were conducted by means of automatic bacteria identification equipment. [Result] The results indicated that the positive rate in the sub-mastitis cows was 65.3%（301/461）. Three pathogenic bacteria were isolated，including 22 Staphylococcus aureus strains，5 Streptococcus agalactiae strains and 10 Escherichia coli strains. These bacteria were resistant to penicillin and ciprofloxacin，but all showed susceptibility to cefotaxime and amikacin. [Conclusion] Pathogens isolated and identified in this experiment were susceptible to cefotaxime and amikacin.

dairy cow；sub-mastitis；bacteria；isolation；identification；drug sensitivity test

S858.23

A

1005-944X（2015）03-0004-04

宁夏回族自治区科技支撑项目（2013ZZN30）

张和平