线粒体功能学研究常用实验方法

刘江涛，王霖霖(综述)，郭 雄，庞清江(审校)

(1.宁波市第二医院骨科中心，浙江宁波315010;2.宁波市第一医院妇产科，浙江宁波315010;3.西安交通大学医学院骨病研究所，西安710061)

线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的双层膜细胞器。线粒体具有自身的遗传系统，但其基因组大小有限，且受核基因组的调控，所以是一种半自主的细胞器[1]。线粒体产生ATP为细胞供能，并在细胞中间代谢产物的氧化、细胞内环境稳态的调节等细胞活动中发挥着重要作用[2]。线粒体是细胞内氧自由基产生的场所，同时本身也是氧自由基攻击的靶目标[3]。线粒体功能障碍可引起细胞内多种信号级联反应、氧化应激反应，并启动程序性细胞死亡，其在几乎所有疾病的发生、发展中起至关重要的作用[4]。线粒体作为细胞病变或损伤时最敏感的指标之一，对其功能的研究是分子细胞病理学检查的重要内容[5]。现就线粒体功能学研究常用实验方法综述如下。

1 线粒体的提取

蔗糖密度梯度离心法是提取线粒体的经典方法[6]，其根据细胞各组分密度的不同，将细胞或组织匀浆液悬浮于均匀的悬浮介质中，采用差速离心的方法进行分离。缓冲的蔗糖溶液(0.25 mol/L蔗糖)比较接近细胞质的分散相，可在一定程度上保持各种细胞器的结构以及酶的活性，成为最常应用的悬浮介质。此外，在pH值=7.2的条件下，各亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。

蔗糖密度梯度离心法的一般步骤是先将细胞或组织制成匀浆，然后利用差速离心法在均匀的悬浮介质中分离，其过程主要包括组织细胞匀浆、分级分离及分析3步。目前这种方法已经成为研究亚细胞成分的化学组成、理化性质及其功能的主要手段。匀浆:在低温条件下，将细胞或组织放到加入等渗匀浆介质的匀浆器中进行破碎，使之成为由各种细胞器及其包含物所组成的匀浆。分级分离:由低速到高速逐级离心沉降，先用低速沉淀较大的颗粒，再用较高的转速沉淀浮在上清液中的颗粒，从而使细胞核、线粒体等各种亚细胞结构得以分离。由于样品中各密度和大小不同的颗粒在离心开始时均匀地分布在离心管中，所以每级离心第1次得到的沉淀必然不是纯的最重的颗粒，还须反复悬浮、离心加以纯化。分析:利用细胞化学和生化方法对分级分离得到的组分进行形态和功能鉴定，常用的是詹纳斯绿活染法。

为保证获得完整的线粒体，必须做到:①全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中;②快速，微量制备操作更方便和快速，因而比大规模制备更易获得完整的线粒体;③充分破碎细胞但不破坏亚细胞器是制备线粒体最关键的环节。与组织块相比，培养细胞(特别是贴壁细胞)用普通玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量且间隙严密的玻璃匀浆器，研杵上下充分研磨培养细胞。在相差显微镜下检查见未裂解细胞在30%～50%即可，过度研磨会破坏线粒体结构，研磨不足则会降低获得率。

此外，线粒体分离提取试剂盒可以快速、简单地从组织或细胞中分离出粗制线粒体。试剂盒提取的粗制线粒体可直接用于线粒体的研究，如线粒体结构分析、功能研究及线粒体相关的凋亡研究等，并可用于制备纯化线粒体及亚线粒体[7]。

2 线粒体耗氧量检测

常用氧电极极谱法检测线粒体的耗氧量[8]。线粒体耗氧量可分为内源性耗氧量和呼吸链复合体耗氧量。内源性耗氧量是指完整细胞在单位时间内的耗氧量，反映了完整细胞整个的氧化磷酸化能力;呼吸链复合体耗氧量是指洋地黄皂苷预处理的细胞，在加入特定的呼吸链复合体底物时单位时间的耗氧量，反映的是特定线粒体呼吸链复合体的氧化磷酸化能力。洋地黄皂苷能结合真核细胞膜上的胆固醇，在细胞膜上形成孔状结构，使细胞膜的通透性增高，细胞内的可溶性物质释放到细胞质外。亚细胞(如线粒体)膜结构上胆固醇的水平非常低，因而不会造成通透性增高。因此，洋地黄皂苷处理的细胞完整地保存了细胞内细胞器及细胞骨架的结构，当加入特定的呼吸链底物或抑制剂时，可准确地反映特定线粒体呼吸链复合体的氧化磷酸化能力。常用的复合物Ⅰ底物为谷氨酸和苹果酸，抑制剂为鱼藤酮;复合物Ⅱ+Ⅲ底物为甘油-3-磷酸和琥珀酸，抑制剂为抗霉素;复合物Ⅳ底物为抗坏血酸和N，N，N'，N'-四甲基对苯二胺，抑制剂为氰化钾。

3 线粒体呼吸链复合体活性检测

常用分光光度法检测线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ的活性[9]。样品一般选择分离纯化的线粒体，每个呼吸链复合体检测需要4～40 μg线粒体蛋白。为了比较不同细胞或组织中线粒体呼吸链复合体的活性，需同时检测三羧酸循环中的枸橼酸合酶的活性作为对照。反应体系在30℃进行，反应体积为200 μL 或1 mL。

复合物Ⅰ活性检测的基本原理:由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide-reduced，NADH)的氧化，NADH减少，导致在340 nm处NADH的吸光度减少(NADH+H++泛醌1→NAD++泛醌1·H2)。

复合物Ⅱ活性检测的原理:由于琥珀酸的氧化，二氯酚靛酚减少，导致在600 nm处二氯酚靛酚的吸光度减少(琥珀酸+泛醌1→延胡索酸+泛醌1·H2;泛醌1·H2+二氯酚靛酚→泛醌1+二氯酚靛酚·H2)。

复合物Ⅲ活性检测的基本原理:由于氧化型细胞色素C的还原，还原型细胞色素C增加，导致在550 nm处还原型细胞色素C的吸光度增加(癸基泛醌·H2+氧化型细胞色素C→癸基泛醌+还原型细胞色素C)。

复合物Ⅳ活性检测的基本原理:由于还原型细胞色素C的氧化，还原型细胞色素C减少，导致在550 nm还原型细胞色素C的吸光度减少(还原型细胞色素C+O2→氧化型细胞色素C+H2O)。

复合体Ⅴ活性检测的基本原理:由于ATP酶水解ATP，NADH减少，导致在340 nm处NADH的吸光度减少(镁·ATP→镁·ADP+磷酸;镁·ADP+磷酸烯醇式丙酮酸→镁·ATP+丙酮酸;丙酮酸+NADH+H+→乳酸+NAD+)。

枸橼酸合酶活性检测的基本原理:由于5-硫-2-硝基苯甲酸根的形成，导致在412 nm处5-硫-2-硝基苯甲酸根的吸光度增加[草酰乙酸+乙酰辅酶A→枸橼酸+辅酶A;辅酶A+5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)→辅酶A·硫代硝基苯甲酸+5-硫-2-硝基苯甲酸根]。

4 线粒体膜电位的检测

线粒体在电子传递链中将H+从基质泵至膜间隙，形成跨线粒体内膜两侧的线粒体膜电位。线粒体膜电位的维持是线粒体正常功能实现的必要条件，膜电位下降会导致线粒体ATP生成不足，进而影响细胞的正常生命活动，其是细胞凋亡过程中最早发生的事件之一[10]。膜电位的降低标志着细胞线粒体膜结构发生一系列改变:膜间通透性转换孔道开放，线粒体内膜通透性增高，内膜H+梯度平衡失常甚至消失，此时，许多亲脂性的阳离子化合物能够结合到线粒体内膜，可以利用流式细胞仪、荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态变化。

罗丹明123是最早发现的线粒体染色剂，其可特异性地被活细胞线粒体摄取，摄取率与线粒体膜电位呈正比，反映了线粒体膜电位的高低，其具有较好的灵敏性，可使用流式细胞仪或荧光分光光度计检测荧光值的变化[11]。

四氯四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(5，5'，6，6'-tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethylben-zimidazole carbocyanide iodide，JC-1)是比罗丹明123更为敏感的荧光探针，它可以检测组织、细胞或纯化的线粒体的膜电位[12]。当线粒体膜电位较低时，JC-1以单体的形式存在，产生绿色荧光;当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，产生红色荧光。基于这种电压依赖性的颜色转变，JC-1是一个很好的电压依赖性荧光染料，可利用荧光显微镜或流式细胞仪对线粒体做定性和定量的分析。

此外，四甲基罗丹明甲酯也是一种应用较多的阳离子荧光染料，单激光激发和单荧光发射峰可用540 nm激光激发，橙红色荧光波长在620 nm左右[13]。相对其他荧光探针，四甲基罗丹明甲酯的主要优点是染料在线粒体的积累仅源于膜电位变化，其与细胞器结合率低，适合做线粒体膜电位的定量分析，其相对毒性更小[14]。

5 ATP水平检测

线粒体最重要的一个功能就是为细胞各项生命活动生成所需的ATP，因此检测细胞内ATP水平变化可直观地反映线粒体的功能状态。通常ATP水平的降低提示线粒体功能受损。在细胞凋亡时，ATP水平的下降通常伴随线粒体膜电位的降低[15]。ATP的检测可以用成色反应、荧光、发光或同位素等方法实现。采用发光法检测ATP具有更高的敏感性，而且简便、快速，是目前最为流行的方法[16]。该方法是基于萤火虫荧光素酶催化荧光素氧化，消耗ATP，从而发出光子的高效发光反应，具有发光效率极高、发光量与ATP水平呈线性关系的优点。ATP是萤光素氧化反应中的限制因素，光的强度与样品中的ATP水平相关。

6 线粒体离子通道检测

线粒体渗透转换孔是一种横跨在线粒体内外膜间的非选择性高导电性通道，通常为关闭状态，是线粒体渗透转换功能的基础。线粒体渗透转换孔对细胞内外多种离子水平的变化非常敏感。钙超载或活性氧类生成等均可诱发线粒体渗透转换孔开启[17]。线粒体大量渗透转换孔的开启可引起膜电位降低甚至崩解，导致线粒体功能损伤、氧化应激以及细胞凋亡。常用的线粒体渗透转换孔检测方法有分光光度法、活性物质标记法及膜片钳法等，其中分光光度法因简单和方便而获得较多应用。

7 活性氧类水平检测

在生物体内，正常生理条件下线粒体能消耗90%以上氧分子产生的能量，约2%的氧分子由于不能被完全还原而与线粒体呼吸链电子漏发生反应，生成超氧阴离子自由基[18]。细胞及线粒体基质中有着完善的抗氧化体系，包括过氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽系统及硫氧还蛋白系统等。正常情况下，细胞内抗氧化防御系统与氧自由基处于一种平衡状态，细胞内活性氧类水平维持在一个比较低的生理范围;在病理情况下，细胞内抗氧化系统与氧自由基的平衡被打破，细胞内活性氧类水平过多，线粒体结构和功能受损，并通过各种途径释放细胞色素C，从而诱导细胞凋亡，影响组织和器官的功能[19]。因此，通过检测细胞内或线粒体活性氧类的水平，以及各种氧化防御体系酶的活性，可反映线粒体的功能状态。细胞内或线粒体活性氧类的水平可采用试剂盒直接检测;超氧化物歧化酶的活性可通过邻苯三酚自氧化法测定;谷胱甘肽系统是细胞内重要的抗氧化系统，其在细胞抵抗活性氧类中起重要作用，谷胱甘肽的水平可通过5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)法测定;丙二醛的水平反映了机体脂质过氧化的程度，可通过硫代巴比妥酸比色法测定[20]。

8 免疫蛋白印迹

免疫蛋白印迹常用的有十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(blue native polyacrylamide gel electrophoresis，BN-PAGE)，此外还有蛋白分离功能更强的双向电泳。

SDS-PAGE是最常用的蛋白质分离鉴定方法。十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)为阴离子表面活性剂，其能够破坏蛋白质的氢键和疏水键，并与蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带有更多的负电荷，因而掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异，导致各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率只与蛋白质的分子质量有关，而不再受原有电荷和分子形状的影响。

BN-PAGE常用于线粒体呼吸链复合体、膜蛋白及同工酶的鉴定和提纯，其是在不加入巯基乙醇、SDS等变性剂的条件下，对保持蛋白质活性的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)。未加入 SDS等变性剂的天然PAGE能够使生物大分子在电泳过程中保持天然的形状和电荷，它们分离的依据是电泳迁移率和凝胶的分子筛作用，因而可以得到比较高的分离效率。电泳分离完成后仍能保持蛋白和酶等生物大分子的活性，因而对后续鉴定有重要的意义[21]。

双向电泳是蛋白质组学的核心技术，随着技术的飞速发展，现已能分离出10000个斑点。其原理简明:第一向是进行等电聚焦，蛋白质会沿pH梯度分离，直至各自的等电点;第二向是再沿垂直方向进行分子量的分离;最后经染色得到的电泳图是一个二维分布的蛋白质图。在线粒体研究中，双向电泳常被用来分离第一向BN-PAGE得到的线粒体呼吸链复合物，因而对于线粒体呼吸链复合物的鉴定有重要意义[22]。

9 线粒体DNA拷贝数

线粒体具有自己的基因组。一般来讲，每个线粒体具有数以百计的线粒体DNA拷贝数，线粒体DNA拷贝数的改变会导致疾病的发生。常用实时荧光定量聚合酶链反应检测线粒体DNA拷贝数的变化。结合两个单独的实时荧光定量聚合酶链反应，对待测样本中线粒体DNA和核基因分别进行定量检测，然后以核基因作为对照，对线粒体DNA拷贝数进行相对定量[23]。

10 小结与展望

线粒体功能受线粒体基因组和核基因组的双重调控，对其准确检测需要联合使用多种实验方法或生物技术。除上述常用方法外，可借助电子显微镜对线粒体形态学变化进行研究;线粒体代谢物活力可检测乳酸、丙酮酸、乳酸脱氢酶等水平;线粒体DNA损伤可利用DNA测序技术、实时荧光定量聚合酶链反应技术、限制性片段长度多态性、单核苷酸多态性、DNA芯片技术及高效液相色谱技术等检测。

虽然现在有很多方法可用来检测线粒体的功能，但是由于实验方法的局限性、所涉及仪器的运行成本及工作人员操作技能等限制，目前大多数方法仍局限于科研。随着实验诊断技术的发展，更加可靠的综合性全基因组分子诊断策略将会逐步建立和完善，这些线粒体功能学研究方法也终将应用于临床。

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