还原型谷胱甘肽对大菱鲆生长及抗氧化能力的影响

李晓美，鲍枳月，吴立新，毕铮铮，许亚琴，翟春雨，陈家俊

(大连海洋大学 辽宁省水生生物学重点实验室，辽宁 大连 116023 )

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，俗称多宝鱼，原产于大西洋东北沿岸，其生长速度快，适应低水温，容易接受配合饲料且转化率高[1]，特别适合我国北方沿海的工厂化养殖[2]。随着产业规模的扩大和养殖模式的转变，在提高产量的同时工厂化养殖模式也给大菱鲆养殖带来一定影响。高密度养殖造成恶化的水环境[3]，在加工、储藏、运输过程中保存不当而氧化酸败的饲料[4]，疾病，运输等管理方面造成的操作胁迫[5]，均会对大菱鲆造成氧化应激，对其生长发育造成损伤，甚至致其死亡。

研究表明，可通过营养调控来消除或缓解胁迫对水产动物造成的应激，其中非营养型免疫增强剂(免疫多糖、抗氧化剂等)可促进其生长和抗胁迫能力[3]。谷胱甘肽(通常指还原型谷胱甘肽)是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸通过肽键形成的广泛存在于细胞中发挥重要作用的活性肽[6]。还原型谷胱甘肽为非蛋白质低分子量的硫醇，属于非酶性的抗氧化剂，其通过电子和质子的传递作用实现清除氧自由基、解毒、维持DNA的生物合成及细胞免疫等多种功能[7]。其中最重要的功能就是维持机体氧化与抗氧化的动态平衡[8]。目前，水产饲料中应用还原型谷胱甘肽的研究表明，饲料中添加适量的还原型谷胱甘肽能显著提高吉富罗非鱼(OreochromisniloticusGIFT)[9]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[10]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[11]、奥尼罗非鱼(O.niloticus×O.aureus)[12]、褐牙鲆(Paralichthysoliveaceus)[13]的生长性能和抗氧化能力；而在草鱼(Ctenopharyngodonidella)饲料中添加还原型谷胱甘肽，对其生长及饵料系数无显著影响，但可以显著提高肝脏中总抗氧化能力，降低肝脏及血清中活性氧水平[14]；饲料中添加还原型谷胱甘肽对皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannailna)的质量增加率无显著影响，但对抗氧化系统起到了改善作用[15]。

笔者选用大菱鲆为试验对象，在基础饲料中添加不同含量的还原型谷胱甘肽，研究其对大菱鲆生长发育和抗氧化能力的影响，确定还原型谷胱甘肽在大菱鲆饲料中的最适添加量，为还原型谷胱甘肽在大菱鲆饲料中的应用及大菱鲆健康养殖提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

以鱼粉、豆粕为主要蛋白源，以高筋小麦粉为主要糖源，以鱼油、大豆磷脂为主要脂肪源配制等氮等能的基础饲料。基础饲料配方及营养组成见表1。在基础饲料中分别添加还原型谷胱甘肽0、100、200、400、600 mg/kg，配制5种试验饲料。

各原料粉碎后过60目筛，按试验配比逐级扩大混合均匀，用制粒机挤压成粒径为2 mm的颗粒饲料，自然风干至水分约10%放入自封袋，置于-20 ℃冰箱冻存备用。

表1 基础饲料配方及营养组成 %

注：①维生素混合物为每千克预混料提供:维生素A ，1 000 000 IU; 维生素D3，300 000 IU; 维生素E，4000 IU; 维生素K3，1000 mg; 维生素B1，2000 mg; 维生素B2，1500 mg; 维生素B6，1000 mg; 维生素B12，5 mg; 烟酸，1000 mg; 维生素C，5000 mg; 泛酸钙，5000 mg; 叶酸，100 mg; 肌醇，10 000 mg; 载体葡萄糖及水≤10%. ②矿物质混合物为每千克预混料提供：NaCl，107.79 mg; MgSO4·7H2O，380.02 mg; NaH(H2PO4)·2H2O，241.91 mg; KH2PO4，665.20 mg; CaHPO4·2H2O，376.70 mg; 柠檬酸铁，82.38 mg; 乳酸钙907.10 mg; Al(OH)3，520.00 mg; ZnSO4·7H2O，990 mg; CuSO4·5H2O，10.00 mg; MgSO4·7H2O，2220 mg; Ca(IO3)2，420 mg; CoCl2·6H2O, 77 mg. ③抗氧化剂为2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT). ④还原型谷胱甘肽，购于Solarbio公司，纯度>98%。

1.2 饲养与管理

大菱鲆幼鱼购于大连天正实业有限公司，投喂基础饲料驯养两周，待其适应饲料和养殖环境后选用无病害无外伤，初始质量为(23.08±0.09) g的个体随机分组进行试验。

试验使用15个60 cm×45 cm×40 cm水族箱(实际用水量90 L)，每个水族箱为1个养殖单位，共设5个处理，每个处理3个重复组，每个重复放养14尾鱼，养殖试验持续8周。试验期间采用自然光照，日投喂2次(8:00和18:00)，投喂30 min后收集残饵。换水1次/d，换水量为33.3%～50%，试验水温14～18.5 ℃，溶解氧>6 mg/L。

1.3 样品采集

试验结束前，将大菱鲆禁食24 h，每箱分别称量质量和计数。每个水族箱随机取5尾鱼，称量其体质量，采集肝脏，称量质量后液氮速冻置于-80 ℃冰箱冻存备用。分别按下式计算质量增加率及特定生长率：

质量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

特定生长率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

式中，m1为初始体质量(g)，m2为终末体质量(g)，t为养殖时间(d)。

1.4 样品测定

取采集的肝脏组织加入预冷的0.86%生理盐水作为匀浆介质(m/V=1/9)在冰水浴下机械匀浆混合均匀，4 ℃，3000 r/min离心10 min，取上清液，进行指标测定。

总蛋白测定使用南京建成生物工程研究所考马斯亮蓝法蛋白定量测试盒；总抗氧化能力的测定使用南京建成生物工程研究所总抗氧化能力测定测试盒，利用抗氧化物质还原Fe2+与菲啉类物质反应比色测定；丙二醛的测定使用南京建成生物工程研究所丙二醛测试盒，利用丙二醛与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物比色进行测定；超氧化物歧化酶的测定使用南京建成生物工程研究所超氧化物歧化酶测试盒；还原型谷胱甘肽的测定使用南京建成生物工程研究所微量还原型谷胱甘肽测试盒，利用微量酶标法测定；谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶的测定使用南京建成生物工程研究所谷胱甘肽过氧化物酶测试盒，利用二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物的反应比色测定；谷胱甘肽硫转移酶使用南京建成生物工程研究所谷胱甘肽硫转移酶测试盒，利用谷胱甘肽硫转移酶催化还原型谷胱甘肽与1-氯2,4-二硝基苯底物结合比色测定。

1.5 统计分析

试验数据均用平均数±标准差表示。采用SPSS 21.0软件对数据进行单因素方差分析。如差异显著(P<0.05)时，用Duncan多重比较检验组间差异。

2 结 果

2.1 还原型谷胱甘肽对大菱鲆生长的影响

饲料中添加还原型谷胱甘肽能不同程度提高大菱鲆的质量增加率和特定生长率，随着还原型谷胱甘肽添加量的增加，大菱鲆质量增加率和特定生长率均呈先升后降的趋势(表2)。其中还原型谷胱甘肽添加量为200 mg/kg的试验组，大菱鲆的质量增加率和特定生长率均显著高于其他组(P<0.05)，其他各组间差异不显著(P>0.05)。通过线性回归分析建立预测模型，经回归方程计算得出，当饲料中还原型谷胱甘肽添加量为189.70 mg/kg时，大菱鲆特定生长率达到最高值1.67%(图1)。

表2 还原型谷胱甘肽对大菱鲆生长的影响(n=3)

注：表中同一列内右上角标有不同英文字母的数据之间差异显著(P<0.05).

图1 还原型谷胱甘肽对大菱鲆特定生长率的影响

2.2 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏丙二醛含量、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力的影响

饲料中添加还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中丙二醛含量、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力均无显著影响(P>0.05)(图2～图4)，随着还原型谷胱甘肽添加量的增加，大菱鲆肝脏中丙二醛含量呈先降后升的趋势，其中对照组丙二醛含量最高，还原型谷胱甘肽添加量为200 mg/kg试验组最低。随着还原型谷胱甘肽添加量的增加，大菱鲆肝脏中总抗氧化能力、 超氧化物歧化酶活力呈先升后降的趋势，其中还原型谷胱甘肽添加量为200 mg/kg试验组最高，分别为(1.99±0.12)、(99.32±3.09) U/mg。

2.3 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中还原型谷胱甘肽含量、谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响

随着饲料中添加的还原型谷胱甘肽含量的增加，大菱鲆肝脏中还原型谷胱甘肽含量和谷胱甘肽过氧化物酶活力均呈先升后降的趋势(图5、图6)。当饲料中还原型谷胱甘肽添加量为200 mg/kg时，大菱鲆肝脏中还原型谷胱甘肽含量最高，其中还原型谷胱甘肽添加量为200 mg/kg和400 mg/kg的试验组，大菱鲆肝脏中还原型谷胱甘肽含量显著高于对照组(P<0.05)。当饲料中还原型谷胱甘肽添加量为200 mg/kg时，大菱鲆肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活力最高，但试验组与对照组之间差异不显著(P>0.05)。

2.4 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中谷胱甘肽硫转移酶活力、谷胱甘肽还原酶活力的影响

随着饲料中添加的还原型谷胱甘肽含量的增加，大菱鲆肝脏中谷胱甘肽硫转移酶和谷胱甘肽还原酶活力均呈先降后升的趋势(图7、图8)。当饲料中还原型谷胱甘肽添加量为200 mg/kg时，大菱鲆肝脏中谷胱甘肽硫转移酶及谷胱甘肽还原酶活力均最低，分别为(38.08±5.68) U/mg、(6.87±0.87) U/g，显著低于对照组(P<0.05)。

图2 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中丙二醛含量的影响

图3 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中总抗氧化能力的影响

图4 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中超氧化歧化酶活力的影响

图5 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中还原型谷胱甘肽含量的影响

图6 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响

图7 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中谷胱甘肽硫转移酶活力的影响图中标有不同英文字母的数据之间有显著差异(P<0.05).下同.

图8 还原型谷胱甘肽对大菱鲆肝脏中谷胱甘肽还原酶活力的影响

3 讨 论

3.1 饲料中添加还原型谷胱甘肽对大菱鲆生长的影响

研究表明，饲料中添加还原型谷胱甘肽会对水产动物生长性能产生积极的影响，可促进水产动物的生长[16]，且作用机制为多方面系统协调的结果。刘晓华等[11]的研究表明，在饲料中添加一定含量的还原型谷胱甘肽能够提高凡纳滨对虾的质量增加率和饲料效率，并指出还原型谷胱甘肽可通过中间代谢产物半胱胺破坏生长抑制分子的二硫键，解除生长抑制素对生长激素的控制，促使生长激素在现有水平上有所提高，从而促进机体生长。赵红霞等[17]研究表明，饲料中添加还原型谷胱甘肽能够通过调节草鱼生长激素水平，提高类胰岛素一号增长因子水平，从而达到促进草鱼生长的作用。周婷婷等[9]研究表明，饲料中添加还原型谷胱甘肽能促进蛋白质的合成，提高吉富罗非鱼的摄食量。并且这些结论在虹鳟[10]、褐牙鲆[13]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[18]和奥尼罗非鱼[19]等试验中均已得到证实。

本试验在基础饲料配方基础上添加不同剂量的还原型谷胱甘肽，结果显示，在大菱鲆饲料中添加还原型谷胱甘肽能显著提高大菱鲆的生长性能，饲料中添加还原型谷胱甘肽的试验组大菱鲆的质量增加率和特定生长率明显高于未添加还原型谷胱甘肽的对照组，并在添加量为200 mg/kg时达到显著水平，与上述试验结果一致。另外，有研究指出，动物肠腔中的还原型谷胱甘肽能将过氧化物清除，从而保护肠黏膜[20]；Venurini[21]的研究提到，还原型谷胱甘肽能提高水螅(Hydraattenuate)的摄食反应。由此可见，还原型谷胱甘肽对大菱鲆生长性能的促进作用是一系列机制作用的结果，具体的生长作用机制还有待进一步研究。

3.2 饲料中添加还原型谷胱甘肽对大菱鲆抗氧化能力的影响

实际生产中，存在很多对生物体造成氧化应激的因素，使机体产生大量活性氧自由基，导致生物体内活性氧的产生超过其分解速率而对其机体甚至生长发育造成损伤。脂质过氧化会导致二次产物的生成，如丙二醛是衡量不同海洋生物活性氧引起氧化应激损伤的重要指标[22]。在本试验中，随着饲料中还原型谷胱甘肽添加量的增加，丙二醛呈先降后升的趋势，其中还原型谷胱甘肽添加组丙二醛的含量均低于对照组，还原型谷胱甘肽添加量为200 mg/kg试验组达到最低，但未达到显著水平。表明还原型谷胱甘肽的外源添加一定程度上减轻了细胞的氧化损伤。

生物体为了在氧化与还原反应中维持平衡，有一整套的抗氧化系统。抗氧化系统不断作用清除自由基，调节机体内活性氧水平，同时参与各种生化反应，有效调控生物体氧化应激，从而保证机体细胞内外环境的稳定和正常的生理机能。试验结果中，随着饲料中还原型谷胱甘肽添加量的增加，试验组中大菱鲆肝脏中丙二醛含量均低于对照组，且结果中总抗氧化能力与超氧化物歧化酶活力的升高也证明了饲料中适量添加还原型谷胱甘肽能一定程度提高大菱鲆抗氧化能力。

本试验饲料中添加还原型谷胱甘肽后，谷胱甘肽过氧化物酶活力的变化呈现与还原型谷胱甘肽、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力相同的变化趋势，但未达到显著水平。可能由于外源性还原型谷胱甘肽的添加，使得两分子还原型谷胱甘肽巯基氧化脱氢转变成一分子氧化型谷胱甘肽，清除了大部分氧自由基，本试验中谷胱甘肽还原酶活性的降低也证明了体内还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的动态平衡，可以依靠外源性还原型谷胱甘肽的添加来调节，而不需要完全由自身内源性氧化型谷胱甘肽在谷胱甘肽还原酶的催化下转化为还原型谷胱甘肽，来提升体内还原型谷胱甘肽含量。这一结果与褐牙鲆[13]的试验结果相似，但与虹鳟[10]、吉富罗非鱼[23]的研究结果不同，所以谷胱甘肽还原酶在大菱鲆体内的作用机制仍需进一步研究。

谷胱甘肽硫转移酶大量存在于肝细胞中，当肝细胞受到损伤时，谷胱甘肽硫转移酶会快速释放到血液中，因此谷胱甘肽硫转移酶也可作为肝脏损伤的敏感指标[24]。在本试验中，随着饲料中还原型谷胱甘肽添加量的增加，丙二醛呈先降后升的趋势，其中对照组最高，还原型谷胱甘肽添加量为200 mg/kg的试验组达到最低，谷胱甘肽硫转移酶呈现与丙二醛相反的趋势。进一步证明了适量添加还原型谷胱甘肽，能降低细胞中的氧化损伤。此外当大菱鲆谷胱甘肽过氧化物酶呈下降趋势时，谷胱甘肽硫转移酶呈对应的上升趋势。这一结果与褐牙鲆[13]、虹鳟[25]的研究结果类似。表明当体内谷胱甘肽过氧化物酶活力低时，谷胱甘肽硫转移酶也可作为抗氧化的保护机制。

3.3 大菱鲆饲料中还原型谷胱甘肽最适添加量

有研究表明，还原型谷胱甘肽虽然作为机体内清除自由基的重要物质，在生物中的浓度达到1 mmol/L时，也可具有促氧化剂作用，造成DNA损伤[26]。另外还原型谷胱甘肽作为氧化物的前体，过多积累也会产生毒性[27]，通过与还原型谷胱甘肽结合，可将一些化合物转化为具有细胞毒性、基因毒性或可导致诱变的代谢物[28]。

本试验表明，饲料中添加还原型谷胱甘肽能一定程度提高还原型谷胱甘肽在肝脏中的积累，并与对照组呈显著差异，这一结果与王芳倩等[13]结果一致。但何芬等[29-30]的研究显示，饲料中添加还原型谷胱甘肽对肝脏中还原型谷胱甘肽的含量无显著影响，这可能和试验对象种类不同有关，具体机制有待进一步研究。

本试验还发现，大菱鲆的生长性能和抗氧化能力随还原型谷胱甘肽含量的增加均呈先升后降的趋势；肝脏中丙二醛的含量在添加量高于200 mg/kg后呈上升趋势，表明在还原型谷胱甘肽添加量超过一定程度后，机体抗氧化能力下降，出现了一定程度的氧化损伤。这一结果与凡纳滨对虾[11]、褐牙鲆[13]、黄颡鱼[18]的研究结果类似。说明只有在还原型谷胱甘肽添加量在合适的范围内，才具有促生长和促抗氧化能力的效果；如果添加过量会导致还原型谷胱甘肽在大菱鲆体内过量积累，导致氧化损伤，可对鱼体产生毒性作用。水产饲料中还原型谷胱甘肽最适添加量因对象种类的不同而有差异，虹鳟饲料中还原型谷胱甘肽最适添加量为200 mg/kg[10]；凡纳滨对虾饲料中还原型谷胱甘肽最适添加量为174.13 mg/kg[11]；褐牙鲆饲料中还原型谷胱甘肽最适添加量为368.92 mg/kg[13]；黄颡鱼饲料中还原型谷胱甘肽最适添加量为357.69 mg/kg[18]；吉富罗非鱼幼鱼饲料中还原型谷胱甘肽最适添加量为355.13 mg/kg[23]；本试验以特定生长率为评价指标，通过线性回归分析建立预测模型，经回归方程计算确定大菱鲆饲料中还原型谷胱甘肽最适添加量为189.70 mg/kg。

4 结 论

大菱鲆饲料中添加适量的还原型谷胱甘肽能促进大菱鲆的生长，提高大菱鲆抗氧化应激能力，清除其体内氧自由基，缓解养殖过程中对大菱鲆造成的氧化损伤，饲料中还原型谷胱甘肽最适添加量为189.70 mg/kg。