硫酸铜对双斑东方鲀刺激隐核虫病的治疗效果研究

吴建绍，李雷斌，朱志煌，钟建兴，苏国强，周 宸，林克冰，方民杰

(福建省水产研究所，福建 厦门 361013 )

双斑东方鲀(Takifugubimaculatus)属鲀形目、鲀科、东方鲀属，为近海暖温性鱼类，其肉质细嫩、鲜美，营养价值高，被誉为“鱼中之王”，深受消费者喜爱。目前双斑东方鲀作为福建当地特色品种在全省规模化养殖，并广泛用于鱼、虾、贝生态高值化混养。我国对双斑东方鲀已开展了生物学特性[1]、人工繁育[2-3]、杂交育种[4]、养殖模式[5-6]和河鲀毒性毒素[7-10]等方面的研究，而关于双斑东方鲀的病害防治研究较少,有待学者深入研究探讨。

刺激隐核虫病，又名“海水小瓜虫病”，是由刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)引起的流行广泛、危害严重的鱼类致死性寄生虫病[11-14]。刺激隐核虫可感染多种海水硬骨鱼类，发病时体表、鳍条和鳃丝易形成肉眼可见的白点，俗称“白点病”；该病传染速度快，如不及时采取措施，可导致感染的鱼类大面积死亡[15-16]；2008年12月农业部第1125号公告将其列为国家二类动物疫病。双斑东方鲀规模化养殖过程中常伴有刺激隐核虫病发生[17]，发病时防治不当，易造成大量鱼死亡。

硫酸铜具有较好驱杀刺激隐核虫作用[18-20]，但有关硫酸铜用于双斑东方鲀病害防治研究未见详细报道。本研究开展了常用药物硫酸铜对双斑东方鲀幼鱼急性毒性试验及对刺激隐核虫病治疗试验，评价了硫酸铜对双斑东方鲀幼鱼的毒性效应，确认了硫酸铜对双斑东方鲀的安全质量浓度及对刺激隐核虫病治疗的质量浓度，为双斑东方鲀养殖生产过程中防治刺激隐核虫病提供了科学研究依据，也为其他经济鱼类防控刺激隐核虫病提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验鱼

1.1.1 试验材料与仪器

Multi-3430多参数水质检测仪、Lw200-20T光学显微镜、Canon-IXUS相机、聚乙烯塑料桶、黑色玻璃钢桶。药物：五水硫酸铜(分析纯)，西陇化工股份有限公司生产。

1.1.2 急性毒性试验鱼

急性毒性试验幼鱼来源于福建省海水鱼类苗种繁育科研中试基地繁育的双斑东方鲀，鱼无伤病、反应灵敏、规格相近且健壮，体长(3.51±0.20) cm、体质量(1.18±0.26) g。

1.1.3 患病的试验鱼

患病的试验鱼来自中试基地繁育的双斑东方鲀，体长(8.18±0.91) cm，体质量(13.08±4.44) g。

病鱼外观症状：体表、鳍条有肉眼可见的“白点”，体表黏液多，少数病鱼游动异常。

1.2 试验方法

1.2.1 急性毒性试验

参照《水生生物毒性试验方法》[21]进行预试验和正式试验，预试验确定正式试验质量浓度范围，在正式试验质量浓度范围内按等对数间距法设置5个硫酸铜质量浓度梯度，每个质量浓度梯度设置3个平行，另设空白对照组(表1)；试验过程采用半静水法，每间隔24 h全部换水更新药液，试验期间不投饵。试验容器为15 L的聚乙烯塑料桶，试验水体为10 L，每桶试验鱼10尾。在试验的过程中仔细观察并记录试验鱼的活动情况和中毒症状，及时捞出死鱼，并记录24、48、72、96 h双斑东方鲀幼鱼的死亡和存活情况。试验用水为砂滤海水，水温(27±1) ℃、盐度23～25，pH 7.90～8.10，溶解氧>6.00 mg/L。

表1 硫酸铜急性毒性试验的质量浓度

1.2.2 患病病鱼检查及病原形态学观察

首先病鱼(带水)外观观察，然后病鱼(出水后)体表、鳃和脏器解剖检查，分析体表、鳃丝及脏器典型性表观病理特征。取鳍条、体表黏液、鳃片以及各内脏组织器官制成水浸片，置于Lw200-20T光学显微镜下观察，进行可疑病原确定及观察其形态特征。

1.2.3 病鱼治疗试验

依据毒性试验结果并按其安全质量浓度以下设置3组硫酸铜用药质量浓度，另设空白对照组(表2)；每组质量浓度梯度设3个平行药浴病鱼，其中2个平行统计病鱼存活情况，另一平行用于病鱼每日取样检查。试验容器为500 L的玻璃钢桶，试验水体为400 L，各桶放养病鱼30 尾，微充气增氧，每日按质量浓度施药，施药前100%换水，用药期间正常投喂适量的饵料。每日施药前，观察和记录各试验组病鱼活动及存活情况，然后自检查的平行组中随机选取2尾病鱼，进行体表外观观察、鳃丝镜检及脏器检查，记录刺激隐核虫虫体特征和数量情况。每日镜检各试验组病鱼，如发现双斑东方鲀鱼体有刺激隐核虫的继续按试验质量浓度药浴治疗；未发现有刺激隐核虫的停止施药，换至自然海水养殖观察至第14 d。试验用水为砂滤海水，水温22～24 ℃、盐度23～25，pH 7.90～8.10，溶解氧>6.50 mg/L。

表2 硫酸铜对双斑东方鲀刺激隐核虫病的治疗质量浓度

1.3 数据统计

1.3.1 急性毒性试验数据统计

统计硫酸铜各质量浓度组的双斑东方鲀幼鱼死亡情况，计算出24、48、72、96 h幼鱼的死亡率，然后根据急性毒性试验结果，应用SPSS 18.0软件和概率单位回归法[22]计算出24、48、72、96 h的半致死质量浓度(LC50)；安全质量浓度(SC)按下式计算[23]：

SC=0.3×48 h LC50/(24 h LC50/48 h LC50)2

1.3.2 治疗试验数据统计

每日施药前，统计硫酸铜各质量浓度组病鱼存活情况，计算出各组双斑东方鲀存活率；镜检各组病鱼的体表和鳃，在显微镜(4×10)下观察4个视野以上，以各视野中虫体数量的平均值为虫体数，记录体表和鳃的刺激隐核虫活体数量，并确认虫体感染程度。

2 结 果

2.1 硫酸铜对双斑东方鲀幼鱼的毒性效应

双斑东方鲀幼鱼暴露在最低质量浓度的硫酸铜试验组中，体色及游动情况正常，与对照组无差别；暴露在高质量浓度的硫酸铜试验组中，幼鱼中毒症状表现：鱼体在水面乱窜，鳃盖张合频率快、呼吸急促，体表体色变浅。当硫酸铜质量浓度为8.00 mg/L时，4 h后出现个体死亡，死亡时鳃张开，躯体变形、翻肚，体色白化，体表黏液多，24 h死亡率为53.3%，48 h死亡率为63.3%，96 h全部死亡；当硫酸铜质量浓度为5.23 mg/L时，48 h死亡率为23.3%，96 h死亡率为50%；当硫酸铜质量浓度为1.50 mg/L时，96 h未发现死亡。随着硫酸铜胁迫质量浓度的升高和胁迫时间的延长，硫酸铜对双斑东方鲀幼鱼毒性明显增强，暴露于各质量浓度组的双斑东方鲀幼鱼死亡率也明显升高(表3)。硫酸铜对双斑东方鲀幼鱼24、48、72、96 h的半致死质量浓度分别为7.94、7.12、5.32、4.44 mg/L，安全质量浓度为1.72 mg/L(表3)。

2.2 病鱼检查及病原形态学观察

外观观察双斑东方鲀病鱼，体表、鳍条和鳃丝有肉眼可见“小白点”(图1a～c)；取体表黏液、鳍条、鳃丝镜检，可观察到卵圆形或椭圆形的虫体，直径为200～400 μm，内部有一个“U”型的大核，显微镜下虫体透明度低且呈黑乳白色，多数难见其大核(图1d～g)；卵圆形或椭圆形虫体前端有胞口结构，虫体体表有均匀一致的纤毛，虫体不透明，能缓慢且不停地旋转(图1h)。病情严重时，病鱼对外界刺激反应迟钝，呼吸困难，离群，游动迟缓，偶尔在水里乱窜，无食欲，体型消瘦，部分病鱼鳍条缺损；镜检鳃丝发现有大量虫体，黏液多(图1i)；肝脏充血严重，腹腔内有大量白色黏液(图1j)；体表形成一层白色混浊状黏膜(图1k)。结合虫体及病鱼特征[24-25]，确定该寄生虫为刺激隐核虫。

表3 硫酸铜对双斑东方鲀幼鱼的急性毒性试验结果

图1 刺激隐核虫及患刺激隐核虫病的双斑东方鲀幼鱼a.双斑东方鲀体表“小白点”(箭头所示)； b.鳍条“小白点”(箭头所示)； c.鳃丝“小白点”(箭头所示)； d.体表黏液的刺激隐核虫(箭头所示,×40)； e.鳍上的刺激隐核虫(箭头所示,×60)； f.鳃上的刺激隐核虫(箭头所示,×40)； g.鳃上刺激隐核虫虫体外包一层薄膜(箭头所示,×40)； h.刺激隐核虫虫体(箭头示胞口，×100)； i.感染严重时，鳃丝上有大量虫体，黏液多(箭头所示)； j.肝脏充血严重(箭头Ⅰ所示)，腹腔有黏液(箭头Ⅱ所示)； k.感染严重的幼鱼体表出现一层白色黏膜(箭头所示).

2.3 硫酸铜对双斑东方鲀刺激隐核虫病的治疗效果

治疗试验结果表明(表4、图2)，1.0 mg/L和1.5 mg/L的硫酸铜质量浓度组对刺激隐核虫病的治疗效果良好，第3 d就出现部分虫体解体(图3a～c)或脱落，刺激隐核虫虫体逐渐减少，至第5 d虫体密度大量降低，第6 d镜检，鳍条、鳃丝和体表未发现有虫体(图3d～f)，至第14 d镜检仍未发现有虫体，鱼游动活泼、活力良好，成活率达100%；0.5 mg/L硫酸铜质量浓度组治疗效果不佳，第3 d开始，双斑东方鲀体表黏液增多，第5 d，虫体增多，双斑东方鲀体表白膜严重，第7 d，双斑东方鲀鳃出现大量黏液团、上皮组织增生，肝脏严重充血(图4)，双斑东方鲀出现大量死亡，第8 d，双斑东方鲀全部死亡，死亡时体表背部覆盖一层黏泥；对照组(0 mg/L)双斑东方鲀病情发展迅速，第3 d，双斑东方鲀体表形成一层白色混浊状黏膜，第5 d，双斑东方鲀全部死亡，死亡时体表背部覆盖一层黏泥。

表4 硫酸铜对患刺激隐核虫病的双斑东方鲀幼鱼治疗效果

注：①体表虫体数量感染程度确定方法[26]：平均虫体数量大于10个时，用“+++”表示；平均数量为5～10个，用“++”表示；平均数量5个以下，用“+”表示；没有虫体的用“-”表示。②鳃虫体数量感染程度确定方法[27]：平均虫体数量为2.0个以上时，用“+++”表示；平均数量为1.0～2.0个，用“++”表示；平均数量在1.0个以下时，用“+”表示；没有虫体的用“-”表示.

图2 硫酸铜治疗过程中双斑东方鲀病鱼存活情况

图3 1.0、1.5 mg/L硫酸铜对双斑东方鲀刺激隐核虫病的治疗情况a.用药前，正常的刺激隐核虫虫体(箭头所示，×40)； b.用药第3 d，刺激隐核虫虫体开始解体(箭头所示，×40)； c.刺激隐核虫虫体解体(箭头所示，×40)； d.用药5 d后，鳍条干净无虫体； e.用药5 d后，鳃镜检无虫体； f.用药5 d后，鱼体表干净无虫体.

图4 0.5 mg/L硫酸铜对双斑东方鲀刺激隐核虫病的治疗情况a.用药后第7 d，鳃出现大量黏液团(箭头所示，×40)； b.用药后第7 d，鳃上皮组织增生(箭头所示，×40)； c.用药后第7 d，肝脏严重充血(箭头所示).

3 讨 论

3.1 硫酸铜对双斑东方鲀幼鱼的毒性评价

硫酸铜属重金属盐类，其铜离子易使病原体体内的酶失去活性，从而阻碍病原体的繁殖、生长，常作为水产养殖药物用于杀灭寄生的原生动物病原[28]。有关硫酸铜对海水鱼类急性毒性研究比较多，不同海水鱼类对硫酸铜耐受能力不一样，如对双棘黄姑鱼(Nibeadiacanthus)[29]的安全质量浓度为0.96 mg/L、对眼斑拟石首鱼(Sciaenopsocellatus)[30]的安全质量浓度为1.65 mg/L、对大菱鲆(Scophtbalmusmaximus)[31]的安全质量浓度为0.46 mg/L、对菊黄东方鲀(T.flavidus)仔鱼[32]的安全质量浓度为0.76 mg/L、对褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)稚鱼[33]的安全质量浓度为0.21 mg/L、对漠斑牙鲆(P.lethostigma)幼鱼[34]的安全质量浓度为0.667 mg/L、对点带石斑鱼(Epinepheluscoioides)幼鱼的[35]安全质量浓度为1.485 mg/L、对斑石鲷(Oplegnathuspunctatus)幼鱼[36]的安全质量浓度为1.42 mg/L。由于硫酸铜对不同鱼类的安全质量浓度差异大，需要通过毒性试验来确定各种鱼类的安全质量浓度，然后结合生产实际确认硫酸铜是否适合治疗该鱼类。本研究结果表明，硫酸铜对双斑东方鲀幼鱼的安全质量浓度为1.72 mg/L，高于生产建议使用的质量浓度0.70～1.0 mg/L，在此安全质量浓度下可放心使用硫酸铜。但使用时需注意，铜离子易在生物体累积，会引起机体生理、生化及组织病理等变化[37]，故生产上忌长期使用；商品鱼上市前应留有足够休药时间，以保证水产品质量安全。

3.2 硫酸铜对刺激隐核虫病的治疗效果

硫酸铜对寄生于海水鱼类的刺激隐核虫、淀粉涡鞭虫(Amyloodiniumocellatum)、车轮虫(Trichodina)、斜管虫(Chilodonella)、瓣体虫(Petalosoma)等纤毛虫类有一定的杀灭效果[18-20,36,38-39]，生产上常用于防治纤毛虫类病害。硫酸铜对海水鱼类刺激隐核虫病临床治疗报道较多，如陆建学等[18]报道，2.0 mg/L硫酸铜治疗黄鲷(Taiustumifrons)刺激隐核虫病经济有效；王印庚等[19]报道，2.0 mg/L的硫酸铜虽能杀死大菱鲆体表刺激隐核虫，但可导致部分病鱼死亡；王忠华等[20]报道，2.0 mg/L硫酸铜可使大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)体表刺激隐核虫活力下降，解体死亡，但因大黄鱼耐受安全质量浓度较低，治疗时易造成大黄鱼死亡；窦海鸽等[40]报道，小剂量硫酸铜会促使刺激隐核虫虫体胞囊形成，加快病情恶化，治疗无效。硫酸铜还可杀灭体外发育各期的刺激隐核虫[41]。本研究结果表明，1.0 mg/L和1.5 mg/L的硫酸铜对双斑东方鲀刺激隐核虫病治疗有效，可以使体表刺激隐核虫活力和数量下降，虫体解体或脱落，用药5 d后治愈；生产上考虑用药经济性，建议使用1.0 mg/L硫酸铜质量浓度治疗。不同鱼类对硫酸铜质量浓度耐受程度不同，如大黄鱼、大菱鲆耐受程度低，双斑东方鲀耐受程度高，治疗时需严格按硫酸铜对各鱼类安全质量浓度来控制使用，同时结合考虑溶解氧、水温、有机质等环境因子和鱼类活动情况，做到科学合理用药，确保治疗安全、有效。

3.3 临床有效防治双斑东方鲀刺激隐核虫病

自日本学者Sikama[42]首次发现刺激隐核虫，至今刺激隐核虫病仍是危害严重的致死性纤毛虫病之一，几乎侵害所有海水养殖经济鱼类，包括大黄鱼、大菱鲆、真鲷(Pagrosomusmajor)、石斑鱼、东方鲀、卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)等[19-20,43-44]，严重威胁鱼类养殖业健康发展。所以临床上有效防治养殖经济鱼类刺激隐核虫病意义重大。

治疗刺激隐核虫病关键因素是治疗时间节点的选择，发病初、中期防治治疗有效，发病后期病情发展快，药物基本上无疗效。双斑东方鲀刺激隐核虫病发生进程为：发病初期(图5a)，病鱼体表、各鳍条出现少量白色小点，带水目测观察，肉眼可见，鳃镜检有少量刺激隐核虫虫体；发病中期(图5b)，病鱼体表、鳍条、鳃等部位出现许多肉眼可见的小白点，体表和鳃黏液多，少数病鱼出现游动异常，在水面游动、摩擦池壁；发病后期(图5c)，病鱼体表形成一层浑浊状白色黏膜，病鱼离群，鱼体消瘦，游动迟缓，反应迟钝，偶尔间歇乱窜，呼吸困难，无食欲，镜检鳃丝发现有大量虫体，黏液多且覆盖鳃丝，鳃上皮细胞增生，肝脏充血严重，腹腔内有大量黏液；死亡期(图5d)，病鱼死亡且体表背部覆盖一层黏泥。本研究治疗试验是在双斑东方鲀发生刺激隐核虫病中期期间进行的。生产实践中，在刺激隐核虫病发病初期用1.0 mg/L硫酸铜药浴治疗双斑东方鲀病鱼，持续药浴3 d，即可治愈；而发病中期需用1.0 mg/L硫酸铜持续药浴治疗5 d以上方可治愈，这应该与发病中期期间部分刺激隐核虫虫体被鱼体表层细胞分泌的增生物包围，形成一层薄膜有关[14](图1h),导致药物消杀虫体时间延长。刺激隐核虫病防治难点在于该病易突然暴发、早期不易察觉，但双斑东方鲀属无鳞鱼，相对其他有鳞的海水鱼类发病早期体表更易观察到“白点”，所以在刺激隐核虫病流行期间养殖生产者要经常目测(带水)观察双斑东方鲀鱼体体表情况，查看是否有肉眼可见的“白点”。通过勤观察，做到对刺激隐核虫早发现、早用药，确保药物治疗及时有效。

图5 双斑东方鲀刺激隐核虫病发生进程(右下角为放大图)a.发病初期，体表有少量肉眼可见“小白点”(箭头所示)； b.发病中期，体表出现许多“小白点”，黏液多(箭头所示)； c.发病后期，鱼体消瘦，体表形成一层浑浊状的白色黏膜(箭头所示)； d.死亡期，死亡病鱼体表背部覆盖一层黏泥(箭头所示).

总之，硫酸铜是治疗刺激隐核虫病有效药物之一，但如果不当使用，不仅造成防治效果不佳或损伤鱼体，甚至还会破坏水生态环境。本研究确定了硫酸铜对双斑东方鲀的安全质量浓度和对刺激隐核虫病的有效治疗质量浓度，为双斑东方鲀养殖过程中临床治疗刺激隐核虫病提供技术支撑，对治疗其他鱼类刺激隐核虫病及其纤毛虫病具有一定指导意义。