丁亚涛,汪之和,2,3,王林林,施文正,2
(1.上海海洋大学 食品学院,上海 201306; 2.国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海),上海 201306; 3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306 )
我国渔业资源丰富,品种繁多。2016年,我国水产品总产量为6.90×107t,同比增长3.01%[1]。由于我国地域辽阔,水产养殖量大,为满足广大消费者对不同地区鲜活水产品的需求,水产品保活运输显得十分重要。
中国消费者长期以来喜食鲜活水产品,在水产品运输中通常采用有水保活运输,但效率较低,成本较高,有必要进一步改善加强。水产品保活的目的是在降低运输成本的基础上提高其存活率,通过物理或化学措施降低其新陈代谢,创造较适宜的生存环境,从而延长其存活时间,提高水产品价值。目前鱼类运输方式各种各样,大部分运输主要通过增加水中溶解氧水平、改变水温、调整盐度和麻醉等方式实现提高运输量和存活率,延长鱼类保活时间[2-3]。国内外现已开发出的保活方法主要有净水法保活、增氧保活、低温保活、麻醉保活、冰温无水保活等,不同保活方法的操作原理、特点和适用对象不同[4-5]。其中麻醉保活运输就是通过抑制神经系统的敏感性,降低水产动物对外界环境的刺激反应,使其处于休眠的麻醉状态,新陈代谢速率和呼吸强度均有所降低,从而提高运输存活率[6]。应用于水产品保活运输的化学麻醉剂就有30多种,最常用的麻醉剂有MS-222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)、丁香酚和二氧化碳等。MS-222具有易溶于水、见效快、复苏时间短,且对处理过的水产品及人体接触均无毒害作用等优点,是目前唯一被美国食品药物管理局批准能用于食用鱼的麻醉剂。缺点是MS-222溶液具有酸性,在麻醉保活时会对鱼体产生影响[7-9]。丁香酚是一种经常使用的植物提取物类麻醉剂,具有较强麻醉效果、廉价易得、溶解性好及对环境无危害等优点而被广泛应用于活鱼运输[5],缺点是复苏时间较长,具有挥发性,麻醉过程中药效会逐渐下降。一定含量的CO2对鱼类及其他水产动物具有麻醉效果,利用CO2作为麻醉剂,不仅可以提高活鱼运输效果,还能降低运输成本,与其他麻醉剂相比,优点在于不需要休药期,经CO2处理过的鱼可以直接销往市场[4],缺点是麻醉时间和复苏时间相对较长,麻醉水溶液的CO2含量范围很窄,最终的麻醉剂量很难控制,且只对部分鱼有麻醉作用[10]。
鳊鱼(Parabramispekinensis)是我国养殖量比较大的品种之一,营养价值较高,含有丰富的优质蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素D等物质,此外,还含有大量的磷和烟酸[11]。笔者采用MS-222对鳊鱼进行麻醉,研究鳊鱼在不同质量浓度MS-222麻醉液中的麻醉效果,包括进入不同麻醉过程和苏醒过程的行为变化的时间和呼吸频率的变化,并研究麻醉后鳊鱼在不同水温及鱼水比中的存活率和保活过程中水质指标及鱼体指标的变化,以期为鳊鱼的保活运输提供参考数据。
试验鳊鱼购于上海市古棕路农工商,体长30~35 cm,体质量500~600 g。
5B-3N便携式氨氮测定仪(上海连华科技有限公司)、ZC-10智能型超级恒温水槽(宁波天恒仪器厂)、UV-1800PC紫外可见分管光度计(上海美谱达仪器有限公司)、Siemens KK26E12TI冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)、JPB-607型便携式溶解氧测定仪(上海精密科学仪器有限公司)、FE20实验室pH计[梅特勒—托利仪器(上海)有限公司]、车载速冻冰箱A50(佛山艾凯电器有限公司);MS-222(上海安谱实验科技股份有限公司)。
1.3.1 不同质量浓度MS-222对鳊鱼麻醉效果的影响
根据预试验确定的6个质量浓度梯度,分别为20、40、60、80、100、120 mg/L,将暂养1 d的鳊鱼放入盛有以上不同质量浓度的麻醉液中,观察鳊鱼的行为特征并记录鳊鱼进入不同麻醉阶段的时间、苏醒时间和复苏率。
在MS-222的作用下,鳊鱼在麻醉和复苏阶段表现出一系列不同的行为变化,本试验参考文献[12-13]中的分期标准,结合鳊鱼的实际情况,将鳊鱼的麻醉过程分为6个时期(表1),复苏过程分为3个时期(表2)。
复苏率/%=n2/n1×100%
式中,n1为试验鱼尾数,n2为试验后处于活体状态的鱼尾数。
1.3.2 不同质量浓度MS-222对鳊鱼呼吸频率影响
将MS-222配制成0、20、40、60、80、100和120 mg/L 7个质量浓度梯度,将鳊鱼放入溶液开始计时,分别记录鳊鱼在60、120、180、240、300、360、420 s时间段内的呼吸次数。呼吸频率以1 min内鳊鱼鳃盖张合次数来表达。
1.3.3 鳊鱼临界温度的测定
采用梯度降温的方式,当水温为10~20 ℃,降温速率为3 ℃/h;水温5~10 ℃,降温速度2 ℃/h;水温低于5 ℃,降温速度1 ℃/h;观察并记录鱼体呼吸规律,将鱼体出现咧鳃现象(未死亡状态)的水温作为其临界温度[14]。
表1 麻醉程度分期及鱼类行为特征
表2 鱼体复苏过程分期及行为特征
1.3.4 不同质量浓度MS-222对鳊鱼保活存活率的影响
选择呼吸频率一致的鳊鱼作为试验对象,在40、60、80、100 mg/L这4个质量浓度梯度进行试验,记录鳊鱼的存活率。
1.3.5 不同水温对鳊鱼保活存活率的影响
选择呼吸频率一致的鳊鱼作为试验对象,在2、7、15、20 ℃这4个温度梯度进行试验,记录鳊鱼的存活率。
1.3.6 不同鱼水比对鳊鱼保活时间的影响
在7 ℃和MS-222质量浓度60 mg/L条件下,对照组和麻醉组分别选择不同鱼水比(2∶1、1∶1、1∶3、1∶5)进行试验,记录鳊鱼保活时间。
1.3.7 鳊鱼保活过程中水体指标的测定
在保活过程中的不同时间段,用离心管分别从保活箱中取25 mL水,用PB-607A便携式溶解氧测定仪测定氧含量;用5B-3N便携式氨氮测定仪测定氨氮含量;用FE20实验室pH计测定pH。
菌落总数的测定:在保活过程中的不同时间段,用离心管从保活箱中取5 mL水,使用国标GB 4789.2—2016方法进行测定。
1.3.8 鳊鱼保活过程中鱼体指标的测定
麻醉组和对照组在保活过程中的不同时间段随机采样,进行指标测定。
肌肉中乳酸和糖原的测定:采用测试盒(南京建成生物工程研究所)测定。
肌肉pH测定方法:准确称量2 g鱼肉于烧杯中,加0.85%生理盐水18 mL,均质后静置0.5 h,使用pH计测定。
血清生化指标的测定:自鱼尾静脉采血,血清中谷草转氨酶、葡萄糖、尿素、乳酸脱氢酶和肌酐采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。
使用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0软件进行分析,在单因素方差分析的基础上采用Duncan多重比较,统计值为平均值±标准差,P<0.05表示数据之间差异显著;利用Origin 8.0软件绘制相关图表。
鳊鱼在不同质量浓度MS-222下进入不同麻醉程度的时间和复苏时间及复苏率见表3、表4。参考文献[12]对有效质量浓度标准的划定,本试验将有效质量浓度定义为:3 min之内鳊鱼的麻醉程度达到Ⅳ期,在清水中5 min内达到苏醒程度Ⅲ期的质量浓度。
表3 鳊鱼在不同质量浓度MS-222麻醉液中进入不同麻醉程度的时间 s
注:“—”表示试验过程中没有出现该列中所表示的麻醉状态;同列平均值间上标字母不同者差异显著(P<0.05).下同.
表4 鳊鱼在不同质量浓度MS-222麻醉液麻醉后的复苏情况
由表3、表4可知,随着MS-222质量浓度的增大,鳊鱼进入相同麻醉时期的时间缩短,而完全复苏的时间延长。在不同质量浓度麻醉下,鳊鱼进入麻醉和复苏的各个阶段差异显著。在较低的质量浓度下(低于20 mg/L)鱼体最终会维持在轻度麻醉期。质量浓度为40 mg/L时,鳊鱼达到麻醉第Ⅳ期时间约218 s,不能进入第Ⅵ期;在质量浓度为100 mg/L和120 mg/L时,鱼体复苏时间长,复苏后活力差,复苏率分别为75%和50%,且在进入麻醉和复苏各个阶段的时间差异显著。而当MS-222质量浓度为60 mg/L和80 mg/L时,鱼体达到麻醉第Ⅳ期的时间小于180 s,复苏率为100%,至复苏第Ⅲ期的时间较长,可能由于达到深度麻醉和休克期,需要较长时间复苏。
呼吸频率是反映鳊鱼麻醉程度的重要指标之一,鳊鱼在不同质量浓度的MS-222中呼吸频率的变化见图1。除在前60 s呼吸频率略微先上升外,在整个麻醉过程中,呼吸频率呈下降趋势,且相同时间内,随着MS-222质量浓度的增加,呼吸频率逐渐下降,与郭丰红等[13]的研究结果相符。对照组呼吸频率几乎不变化,在低质量浓度(20~40 mg/L)的MS-222中,鳊鱼未出现咧鳃现象,在水中能游动,且随着时间的延长其呼吸频率不断下降,直至慢慢静止在水中;在MS-222质量浓度60~80 mg/L时,随着MS-222质量浓度的升高,呼吸频率下降速率逐渐加快,可见在此质量浓度范围内,产生的应激反应较小;而在MS-222质量浓度100~120 mg/L时,呼吸频率在短时间内直线下降,出现咧鳃现象,说明鱼体在短时间产生了较大的应激反应。
图1 鳊鱼在不同质量浓度中各个时间段呼吸频率的变化
随着水温的降低,鳊鱼的呼吸频率不断下降,当温度降至10 ℃时,鳊鱼基本上不活动,静止在水中,温度降至约5 ℃时,鳊鱼逐渐平躺在水中,呼吸次数减缓,当温度降至2 ℃,鳊鱼的呼吸极不规律,偶尔咧鳃,接近死亡,因此2 ℃可以被认为是鳊鱼低温保活的临界温度。
不同麻醉剂质量浓度对鳊鱼保活的存活率影响见图2。随着保活时间的延长,鳊鱼的存活率下降,40 mg/L质量浓度下鳊鱼存活率16 h前无变化,16~24 h降低,保活24 h后鳊鱼存活率降至50%,60 mg/L质量浓度下鳊鱼存活率24 h内无变化,保活24 h后存活率仍为90%,80 mg/L质量浓度下鳊鱼存活率12 h后下降,24 h后存活率降至10%,100 mg/L鳊鱼存活率12 h全部死亡。
温度对鳊鱼保活率的影响见图3、图4。20 ℃麻醉组和对照组保活12 h存活率分别为60%和40%,24 h后均全部死亡;15 ℃麻醉组和对照组保活12 h存活率分别为80%和60%,24 h存活率分别降至60%和20%,在7 ℃时麻醉组和对照组保活12 h存活率为100%,24 h麻醉组和对照组存活率分别降至80%和60%,2 ℃麻醉组和对照组保活6 h鳊鱼出现死亡,24 h均全部死亡。
图2 不同质量浓度MS-222对鳊鱼保活的存活率影响
图3 不同温度对对照组鳊鱼存活率的影响
图4 不同温度对麻醉组鳊鱼存活率的影响
鳊鱼保活运输中鱼水比与存活时间的关系见图5。鳊鱼保活时间随着鱼水比的增加而延长,麻醉组在鱼水比自2∶1降至1∶1时,保活时间延长9 h,比对照组延长2 h,自1∶3降至1∶5的保活时间延长5 h,比对照组延长1 h。在鱼水比1∶5时,麻醉组保活时间比对照组延长7 h。
图5 麻醉组和对照组鱼水比对鳊鱼保活时间的影响
2.7.1 氨氮的变化
保活开始前,保活箱内水为经过充分曝气2 d的自来水,氨氮含量几乎为0,随着保活时间的延长,水中氨氮的含量先是快速上升,而后升速减缓,其中对照组保活24 h氨氮质量浓度升至4.3 mg/L,麻醉组保活24 h氨氮质量浓度升至3.05 mg/L(图6)。
图6 鳊鱼保活过程水质氨氮浓度的变化
2.7.2 溶解氧水平的变化
溶解氧水平在保活中呈现下降的趋势,对照组和麻醉组开始保活时的溶解氧水平均为6.8 mg/L,12 h后麻醉组和对照组溶解氧水平分别降至3.5 mg/L和1.8 mg/L,24 h后麻醉组和对照组溶解氧水平分别降至2.1 mg/L和0.9 mg/L(图7)。
2.7.3 pH和微生物的变化
在保活过程中pH为6.9~7.8,略有上升(图8);在保活过程中对照组和麻醉组水体中菌落总数上升速率均呈现先慢后快的现象,麻醉组略低于对照组;麻醉组和对照组保活24 h,菌落数量分别升至2.61 log(cfu/mL)和2.75 log(cfu/mL)(图9)。
图7 鳊鱼保活过程水质溶氧量的变化
图8 鳊鱼保活过程水质pH的变化
图9 鳊鱼保活过程水质菌落总数的变化
糖原和乳酸两者的趋势呈负相关。糖原含量随保活时间延长而下降,保活24 h后麻醉组糖原含量降低了19.1%;乳酸含量随保活时间延长而上升,麻醉组保活24 h后乳酸含量上升了78.1%(图10)。保活过程中麻醉组和对照组随保活时间的延长鱼体肌肉pH呈现下降趋势,麻醉组保活24 h,pH下降了0.21,下降趋势低于对照组。
图10 保活过程肌肉中乳酸、糖原、pH的变化
鱼体在保活过程血清生化指标的变化见表5。麻醉组鳊鱼保活12 h和24 h之后, 乳酸脱氢酶活性分别上升了23.8%和102.2%,麻醉前后变化不显著,保活12 h和24 h之后均显著变化。在麻醉保活中,12 h内血清谷草转氨酶活性变化不显著,24 h时则增长了4.4倍,但明显低于对照组。麻醉初期血糖变化不明显,保活24 h后升至3.83 mmol/L,增幅达67.2%,但仍大大低于对照组(239%)的增幅。保活过程中尿素、肌酐都随保活时间的增加而上升,麻醉24 h后,尿素增加了32.2%,肌酐上升了177.4%,但二者的增幅均低于对照组的增幅。
表5 鳊鱼麻醉运输后血清生化指标的变化
注:同行平均值间上标字母不同者差异显著(P<0.05).
MS-222质量浓度低于20 mg/L时,鳊鱼不能进入麻醉期;MS-222质量浓度大于100 mg/L时,鱼体麻醉后复苏率降低。主要原因可能是MS-222进入鱼体后主要聚集在其脾脏、肝脏中,质量浓度过高,大剂量的麻醉剂会麻痹呼吸和舒缩中枢,导致鱼体死亡[15]。随着MS-222质量浓度的升高,呼吸频率下降速率逐渐加快,这一研究与MS-222麻醉鳜鱼(Sinipercachuatsi)[15]、金鱼(Carassiusauratus)[16]的结果一致。试验发现,在MS-222质量浓度60~80 mg/L时,鱼体产生的应激反应较小;而在MS-222质量浓度为100~120 mg/L时,鱼体在短时间产生了较大的应激反应。综合考虑,MS-222麻醉鳊鱼的有效质量浓度应选择60~80 mg/L,这与MS-222麻醉褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[17](有效麻醉质量浓度60 mg/L)的结果相似,与麻醉鳜鱼[15](有效麻醉质量浓度200~220 mg/L)和加州鲈鱼(Micropterussalmoides)[18](有效麻醉质量浓度10~20 mg/L)的结果相差较大。表明不同鱼种之间MS-222麻醉效果存在一定差异。
试验保活24 h后,MS-222质量浓度为60 mg/L时鳊鱼的存活率高于其他质量浓度。这可能由于低质量浓度的MS-222对鳊鱼的麻醉较浅,达不到深度麻醉;在高质量浓度下,鳊鱼进入深度麻醉时间过快,超过鱼体的耐受值,对鱼体产生一定毒害作用,导致鱼体死亡[16]。
温度是影响鱼类生理状况的重要因素之一,鱼类为变温动物,其生理状况受环境温度的影响较大,有相应的生存温度带和最佳生存温度,当超出生存温度范围时,机体会出现一系列的不良反应,导致机体免疫力低下甚至死亡[19]。20 ℃时麻醉组和对照组鳊鱼保活24 h后均全部死亡,这由于温度过高鱼体的新陈代谢速率较高,氧气消耗量大[20],致使水中溶解氧水平过低,鱼体缺氧而死亡;15 ℃麻醉组和对照组鳊鱼保活24 h存活率较低,这可能由于麻醉条件下能降低鱼体新陈代谢,减少了氧气消耗,减缓鱼体死亡;7 ℃时保活24 h麻醉组和对照组存活率较好,可能由于在较低温度下,鱼体新陈代谢较低,同时能够满足鱼体氧气的消耗,说明该温度下鳊鱼皮肤呼吸和鳃呼吸结合效率最好;2 ℃麻醉组和对照组保活6 h鳊鱼出现死亡,24 h均全部死亡,这可能由于在该临界温度下,鱼体本身需要提供能量来应对外界低温,呼吸频率下降,无法满足鱼体用氧而致其死亡,说明鳊鱼不适合临界温度保活。从各温度段考察,在7 ℃条件下麻醉鳊鱼的保活时间较长、存活率较高。
在水产品保活运输中,降低鱼水比是保活运输需要考虑的重点之一[21],由试验结果可知,麻醉组对鳊鱼保活有着积极影响,在各个时间阶段的保活时间均高于对照组,所以综合考虑选择鱼水比1∶3麻醉条件进行保活运输,符合保活运输经济利益最大化。
氨氮是一种神经毒性物质,如果在水中的含量过高,鱼体血浆中的氨排出量就会相应减少,从而导致血浆中氨含量升高,引起毒性反应[22]。高含量的氨氮会对鱼体造成伤害,多数鱼类的养殖氨氮水平应低于2.79 mg/L[23],其中对照组和麻醉组保活24 h分别比标准高出54.1%和9.3%。由此可知,氨氮含量的升高会影响鳊鱼保活时间的延长。另一方面,麻醉能降低鱼体代谢产生氨氮,减缓水质恶化,更利于鳊鱼的存活。在试验过程中观察到,保活开始前,水清澈无味,而保活24 h后水微发黄,变得浑浊。
溶解氧对于鱼类等水生生物的生存至关重要,多数鱼类在溶解氧水平低于3~4 mg/L时就难于生存[24],由试验结果可见,保活12 h后麻醉组溶解氧水平是同一时间对照组溶解氧水平的1.9倍,在这一时间之后对照组鳊鱼出现死亡,麻醉组鳊鱼存活率为100%,这可能由于麻醉减少了鳊鱼对溶解氧的消耗,延长了保活时间。
综上可知,氨氮含量的上升和溶解氧水平的下降是导致鳊鱼死亡的重要原因。
在保活过程中pH变化为6.9~7.8,略有上升,与淡水鱼水体pH 6.6~8.5基本一致[25],所以水质pH的变化对鳊鱼影响不大。菌落总数是评价水质污染程度的重要指标[26],在渔业水质标准中要求大肠杆菌(Escherichiacoli)密度低于5个/mL[25]。在保活过程中对照组和麻醉组保活24 h菌落数量麻醉组略低,水质中细菌总数增加,会引起耗氧量增加,也会导致水质浑浊度增加,从而影响鱼体保活时间。
当鱼体处于饥饿状态,血液中的葡萄糖不能满足鱼体的消耗,鱼类利用肝糖原的能力差,主要分解肌糖原;乳酸与糖原两者之间的变化存在密不可分的关系,在肌肉、血液和肝脏3种组织中乳酸、糖原和葡萄糖的含量水平有着相应的关系[27]。试验发现,麻醉组糖原下降速率和乳酸上升速率均小于对照组,原因可能是由于麻醉组鳊鱼新陈代谢低于对照组,当鱼体处于饥饿状态,血液中的葡萄糖不能满足鱼体的消耗,鱼类会分解肌糖原,在缺氧条件下进行无氧代谢,糖原分解产生大量乳酸[27]。试验发现,保活24 h,麻醉组鱼体肌肉pH呈现下降趋势,低于对照组。这可能是由于鳊鱼肌肉中糖原在无氧呼吸产生能量的同时生成了乳酸,乳酸在肌肉中不断积累,引起肌肉pH的变化;麻醉组代谢较低,乳酸积累少,故pH降幅低于对照组的降幅[28]。
麻醉能够缓解鱼体在保活过程中的应激反应。其中,乳酸脱氢酶是糖代谢中催化丙酮酸转化成乳酸的酶,无氧酵解、心肌梗死、肝脏疾病、肌肉损伤等均会导致乳酸脱氢酶的升高[29],麻醉组鳊鱼保活12 h和24 h之后,乳酸脱氢酶活性均显著变化,可能是鱼体无氧呼吸导致肝脏、心肌受损,乳酸脱氢酶活性上升,这也是鱼体在保活过程中死亡的原因之一。此外,麻醉组乳酸脱氢酶的活性均低于对照组,说明麻醉可以减少鱼体肝脏和心肌的受损。谷草转氨酶是肝脏中连接糖、脂质、蛋白质代谢的重要酶,正常情况下血清谷草转氨酶活性很低而且相对稳定,当肝脏、心肌受到损伤时血清谷草转氨酶活性会升高[30-31],在麻醉保活中,麻醉前后和保活12 h内谷草转氨酶活性变化不显著,24 h时显著变化,但变化趋势明显低于对照组,说明保活过程中,鱼体心肌、肝脏受到一定程度的影响,但麻醉能在一定程度上减少鳊鱼心肌、肝脏受到的损伤。
血糖除受胰岛素和肾上腺素的控制外,还受机体的各种因素调节。因此,机体血糖含量处于一种动态平衡状态,很容易发生变化[32]。麻醉初期血糖变化不明显,保活24 h显著变化,但变化趋势均低于对照组。这与麻醉条件下减缓了糖原的分解有关。另外,在无氧条件下发生酵解产生乳酸,乳酸大部分会进入血液,血液中乳酸量增加会对血红蛋白运输氧的能力产生影响,造成血液氧结合量减少[33],从而导致鱼体供氧量减少,这可能是影响鱼体存活的重要因素之一。
尿素、肌酐含量的变化能够反映肾功能的代谢情况,尿素也是维持血液渗透压的主要成分[34],肾脏机能发生障碍,血尿素和肌酐的含量会升高[32],保活过程中尿素、肌酐均随保活时间的增加而上升,麻醉24 h后,尿素和肌酐显著变化,但二者的增幅均低于对照组,说明在整个保活过程中肾功能受到一定程度的损伤,这也是造成鱼体出现死亡的原因之一。综合以上指标可见,麻醉组保活效果好于对照组,这与麻醉保活的存活率较高是一致的。
试验结果发现,麻醉液质量浓度为60~80 mg/L时,鱼体达到麻醉第Ⅳ期时间均小于200 s,复苏时间相对较短,复苏率为100%。此时应激反应相对较小,为鳊鱼保活有效麻醉质量浓度。7 ℃水温、鱼水比1∶3时保活时间最长,鱼体存活率最高,水质指标结果表明,随着保活时间的延长,氨氮含量、微生物总量、pH均呈上升趋势,而溶解氧水平则下降,这是导致鳊鱼保活时间缩短和存活率下降的外部原因,麻醉组保活效果明显好于对照组,说明麻醉能够减缓鳊鱼氨氮的代谢、减缓水质的恶化、延长鳊鱼的保活。鱼体指标结果表明,随着保活时间的增加,麻醉保活组肌肉中糖原、pH下降,乳酸含量上升。血清指标中乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、血糖、尿素、肌酐均有显著增加,从而影响到鳊鱼的生理机能,但其变化幅度均小于对照组。由此可见,使用MS-222对鳊鱼进行麻醉保活能够减缓鳊鱼的应激反应,降低在保活过程中鱼体受到的损伤,延长保活时间,提高存活率。