Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼的急性毒性

王 鑫，赵海涛，万玉美，孙桂清，崔兆进，吴 彦，陈秀玲

(1.河北农业大学 海洋学院，河北 秦皇岛 066000；2.河北省海洋与水产科学研究院，河北 秦皇岛 066000；3.秦皇岛北戴河新区海洋和渔业局，河北 秦皇岛 066000)

随着海水集约化养殖的飞速发展，工厂化全封闭循环水养殖过程中的铬等重金属污染问题开始引起关注。铬的主要存在形式为Cr(Ⅵ)，其毒性是Cr(Ⅲ)毒性的100倍。工厂化养殖中，Cr(Ⅵ)的主要来源为排放的工业废水、空气沉降以及集约化养殖设备和饲料中的Cr(Ⅵ)污染，其可通过皮肤、消化道、呼吸道进入养殖动物体内，引起机体中毒。近年来，有很多关于Cr(Ⅵ)胁迫对水生生物影响的研究。雷忻等的研究表明，金鱼在Cr(Ⅵ)胁迫下的LC大于草鱼、鲫和泥鳅；梁峰等的研究表明，在铬中毒后黄颡鱼仔鱼和稚鱼的活动能力变弱，游动变慢，反应变迟钝，后相继出现死亡情况；考庆君等、杨燕等的研究表明，铬毒性作用的器官主要是肝腺和肾腺；张彩明等的研究表明，重金属诱导机体产生活性氧，进而导致机体组织抗氧化酶活性发生改变。

大菱鲆()是我国主要海水经济养殖品种之一，因其肉质鲜美，受到人们喜爱，2020年其产量达110 984 t。工厂化集约化养殖是大菱鲆主要养殖模式，Cr(Ⅵ)污染对大菱鲆养殖的危害不容忽视。但到目前为止还没有Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼急性毒性的研究。为此，本实验以大菱鲆幼鱼为实验对象，采用静水实验法进行Cr(Ⅵ)胁迫下的急性毒性实验，研究在其胁迫下大菱鲆幼鱼肝胰腺内过氧化氢酶(CAT)活性的变化；观察大菱鲆幼鱼在Cr(Ⅵ)胁迫下的行为，通过急性毒性实验得出半致死浓度和安全浓度，以期为大菱鲆养殖中的水质评价提供参考依据，为其他重金属离子和Cr(Ⅵ)的复合污染物的毒性研究提供借鉴，并为制定海洋渔业和水质标准提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 实验所用大菱鲆幼鱼均采自河北省秦皇岛市昌黎县半滑舌鳎良种场，外形完好、无疾病，平均体长为(6.00±0.40)cm，平均体质量为(8.19±1.47)g。实验前将大菱鲆幼鱼置室内养殖池暂养7 d。暂养期间保持24 h充氧，日换水一次，换水量为50%，及时清理池底粪便及残饵。早8:30和下午5:30准时少量喂食高能颗粒饲料两次，暂养期间死亡率小于2%，实验前一天停止投喂。

1.1.2 实验条件 本实验采取静水实验法，实验期间不投饲不换水。实验容器为聚乙烯桶，实验期间水温恒定，持续充氧。实验用水为深井卤水和淡水混合配制而成，然后经砂滤池过滤，水温为(15.0±2.0)℃。符合《渔业水质标准》(GB 11607-1989)。

1.2 实验方法

1.2.1 预实验 预实验严格按照《海洋监测规范 第7部分 近海污染生态调查和生物监测》(GB 17378.7-2007)进行，成体每克鱼体质量1 L用水量。预实验采取静水实验法，实验期间不投饲不换水，及时捞出死亡个体并记录。死亡标准为用玻璃棒触碰鱼的尾部，多次刺激，鱼没有反应则判定为死亡。预实验Cr(Ⅵ)浓度梯度设置为20、40、80、160、320 mg/L，每组设置3组平行。每个实验桶暂养10条大菱鲆幼鱼，持续充氧。通过预实验找出大菱鲆幼鱼在不同浓度Cr(Ⅵ)胁迫下的最大全存活浓度和最小全致死浓度。

1.2.2 正实验 根据预实验得出的结果，在最大全存活浓度和最小全致死浓度之间选取7个等对数比浓度组作为正实验的浓度组，浓度分别为22.91、30.20、40.00、52.48、69.18、91.20、120.22 mg/L，同时设置一个空白对照组。实验组和对照组每组设置3组平行，每个处理组12条大菱鲆幼鱼，水体积100 L，持续充氧。实验期间每6 h观察一次，观察大菱鲆幼鱼的行为表现及体表变化，实验过程中及时捞出死亡个体并记录。

1.3 数据处理

急性毒性所有数据采用Excel和SPSS软件进行整理，运用概率单位法制作散点图，画出趋势线。

2 结果与分析

2.1 Cr(Ⅵ)胁迫下的大菱鲆幼鱼的中毒症状和行为变化

Cr(Ⅵ)胁迫下的大菱鲆幼鱼的中毒症状和行为变化见表1。在急性毒性实验过程中，空白组及平行组大菱鲆幼鱼均未出现死亡情况，幼鱼表现平静，多数时间伏于水底。低浓度组(22.91、30.20、40.00、52.48 mg/L浓度组)大菱鲆幼鱼较为安静，大部分幼鱼伏于水底，个别会游到水面上沿桶壁正常游动，未见明显异常状况。随着实验的进行，幼鱼的鳃、口及体表有少量的Cr(Ⅵ)与体液的橙黄色复合物附着。在高浓度组(69.18、91.20、120.22 mg/L浓度组)，刚放入高浓度Cr(Ⅵ)母液时，大菱鲆幼鱼显得焦躁不安，在桶内游动迅速，翻滚打转，摆尾迅速，呼吸加快，出现浮头现象；再过一段时间后，幼鱼变得安静下来，伏于水底不动，在受到外界刺激后，反应变得迟钝，明显看到幼鱼的鳃、口及体表有较多的Cr(Ⅵ)与体液的橙黄色复合物附着；到后期大菱鲆幼鱼有的鳃和口充分张开，有的鳃没有明显变化但是处于翻背状态，用玻璃棒多次触碰这些鱼的尾部，鱼无反应，判定为死亡。

表1 不同浓度Cr(Ⅵ)暴露下的大菱鲆幼鱼的中毒表现及行为

2.2 Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼的急性毒性

不同浓度Cr(Ⅵ)胁迫下大菱鲆幼鱼的死亡情况见表2。研究表明，到48 h时，22.91、30.20、40.00、52.48 mg/L等低浓度组均未出现死亡情况；69.18 mg/L浓度组出现较少的死亡情况，死亡率8.33%；69.18 mg/L到120.22 mg/L浓度组死亡数量迅速增多，死亡率由8.33%增长到95.8%。到72 h时，2个低浓度组(22.91 mg/L和30.20 mg/L)仍未出现死亡情况；40.00 mg/L到69.18 mg/L浓度组死亡数量逐渐增加，死亡率由37.5%逐步增长到87.5%；2个高浓度组(91.20 mg/L和120.22 mg/L)死亡率达到100%。到96 h时，各浓度组均出现死亡情况，22.91 mg/L到40.00 mg/L浓度组死亡率由29.2%增长到83.3%；52.48 mg/L及以上浓度组死亡率均达到100%。空白对照组在96 h内未出现死亡情况，故排除水质等外界因素对死亡情况的影响。

表2 不同浓度Cr(Ⅵ)胁迫下大菱鲆幼鱼的死亡率 %

不同浓度Cr(Ⅵ)胁迫下，大菱鲆幼鱼48、72、96 h 的死亡趋势见图1，由图1可知，大菱鲆幼鱼死亡率的概率单位与Cr(Ⅵ)的浓度对数的48 h、72 h和96 h回归方程分别为=13.167-20.76，=6.208 3-5.278 3，=6.25-4.006 7；相关系数分别为0.982、0.993 4、0.990 1，均大于0.98，表现为很好的正相关性。

图1 不同浓度Cr(Ⅵ)胁迫下大菱鲆幼鱼的死亡趋势

Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼的急性毒性实验分析见表3。大菱鲆幼鱼48、72、96 h的Cr(Ⅵ)半数致死浓度LC50分别为90.449、45.248、27.606 mg/L，其95%置信区间分别为78.632～104.016、24.110～84.918、19.643～38.797 mg/L。Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼的安全质量浓度为2.760 6 mg/L。48 h的95%置信区间范围小于72 h的95%置信区间范围，说明Cr(Ⅵ)在48 h到72 h之间致毒能力减弱。但72 h的95%置信区间范围明显大于96 h的95%置信区间范围，说明Cr(Ⅵ)在72 h到96 h之间致毒能力明显增强。

表3 Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼急性毒性实验分析

3 讨论

在鱼类急性毒性实验中，依据国家标准，重金属离子的级别根据96 h LC可分为低毒、中毒、高毒和剧毒，范围分别为>10、1～10、0.1～1、<0.1 mg/L。本实验求得Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼的96 h LC为27.606 mg/L，证明Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼的毒性级别属于低毒。安全质量浓度(SC)为0.1倍96 h LC，即为2.760 6 mg/L，我国标准渔业水质规定：养殖水体铬含量≤0.1 mg/L。实验测得安全质量浓度为标准水质的27.6倍，可见大菱鲆幼鱼在Cr(Ⅵ)超标的水中仍能存活，证明大菱鲆幼鱼对Cr(Ⅵ)的耐受性较强。在大菱鲆养殖过程中应该加强对水质的控制，防止养殖水体Cr(Ⅵ)超标，以避免对人类健康产生影响。

Cr(Ⅵ)易被吸收并具有强氧化性，花日茂的研究表明Cr(Ⅵ)能氧化生物大分子，与蛋白质分子上的羟基结合，使蛋白质分子变性。研究表明，低浓度的Cr(Ⅵ)可导致机体的SOD、CAT的酶活性降低，但是对生物没有明显的毒性作用，并能促进生长。高浓度的Cr(Ⅵ)可导致机体细胞DNA链断裂。Cr(Ⅵ)可通过鱼体表、鳃进入鱼体，从而在鱼体内残留，刺激并腐蚀黏膜，导致组织损坏。在实验过程中通过解剖高浓度Cr(Ⅵ)胁迫下的大菱鲆幼鱼，发现其肝胰腺变黑，也印证了这一点。Cr(Ⅵ)还与黏液一起附着在鱼的体表或者鳃上。研究表明，重金属离子对水生生物体的作用机理大多是重金属离子与黏液一起附着在鳃上，导致机体缺氧。本实验研究发现，随着Cr(Ⅵ)浓度的增加，大菱鲆的死亡率也逐渐增加，两者呈现正相关趋势。在同一时间段内，大菱鲆幼鱼死亡率随Cr(Ⅵ)浓度的增加而增加，两者也呈正相关趋势。在高浓度的Cr(Ⅵ)胁迫下，明显观察到大菱鲆幼鱼的体表有Cr(Ⅵ)与黏液的复合物附着在上面。大菱鲆幼鱼在高浓度的Cr(Ⅵ)实验桶中明显呼吸速率加快，行动变得迟缓，逐渐丧失活动能力，最终死亡。

4 结论

实验表明，大菱鲆幼鱼随着Cr(Ⅵ)浓度的增加，表现出呼吸加快，行动逐渐迟缓，体表充血等症状，最终死亡。大菱鲆幼鱼的鳃和体表有Cr(Ⅵ)与黏液结合物附着，Cr(Ⅵ)进入大菱鲆体内引起组织病变，导致肝胰腺变黑。Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼的 96 h LC为27.606 mg/L，安全质量浓度为2.760 6 mg/L。Cr(Ⅵ)对大菱鲆幼鱼具有毒性作用，毒性级别为低毒，同时大菱鲆幼鱼对Cr(Ⅵ)表现出较强的耐受性。