固相萃取—高效液相色谱—四级杆飞行时间质谱法检测芥子气染毒血样中的三肽加合物

杨柳　刘勤　郭磊　谢剑炜

[摘 要] 三肽加合物，（S-2-羟乙基硫代乙基）-半胱氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸[（S-HETE）-Cys-Pro-Phe]是芥子气染毒后体内重要生物标志物之一。本文首先合成并纯化（S-HETE）-Cys-Pro-Phe，应用固相萃取-高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法对其进行定性定量分析。将芥子气染毒血样经Hitrap Blue亲和柱提取白蛋白，选择链霉蛋白酶进行酶解，应用固相萃取柱进行富集净化，采用四级杆飞行时间质谱进行检测。

[关键词] 三肽化合物；固相萃取；高效液相色谱四级杆飞行时间质谱法

中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2015）02-067-03

DOI：10.11876/mimt201502025

芥子气（mustard gas）是一种糜烂性军用化学毒剂，素有“毒剂之王”之称。芥子气曾多次应用于战争中，造成大量人员伤亡，是经过“战争考验”最有效化学战剂之一[1]。对芥子气染毒人员进行体内生物标志物检测，能够为染毒人员临床诊断、鉴定，伤员中毒程度评估以及实施及时、合理救治提供重要技术手段和科学依据，同时也为阐明芥子气中毒机理、研制抗毒药物提供技术支持。

芥子气是一种典型双功能烃化剂，具有复杂生物学作用，可与体内许多重要生物大分子，如核酸、蛋白质、酶等发生亲核反应形成各种加合物[2]。芥子气进入人体后可与血液中人血清白蛋白（HAS）加合，第34位半胱氨酸巯基是其烃化位点之一，在链酶蛋白酶水解作用下，该位置半胱氨酸与其后脯氨酸、苯丙氨酸一起形成特征三肽加合物（S-2-羟乙基硫代乙基）-半胱氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸[（S-HETE）-Cys-Pro -Phe]，采用固相萃取进行前处理后，可应用LC-MS/MS进行定性定量分析，其浓度与芥子气染毒浓度成正比[3]。因此（S-HETE）-Cys-Pro-Phe可以作为芥子气染毒生物标志物开展进一步研究。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 1200 LC & 6520 Q-TOF MS 四级杆飞行时间质谱仪（Agilent，美国）；HiTrap Blue HP亲和柱（1mL，GE，美国）；真空固相萃取装置（Waters，美国）；HLB固相萃取小柱（30 mg，1 mL，Waters，美国）；隔膜泵-离心蒸发浓缩仪（Labconco，美国）；5418型高速离心机（Eppendorf，德国）；10 kDa超滤管（Millpore，美国）；LGJ-18C型冷冻干燥机（四环科学仪器厂，中国）；THZ-D台式恒温振荡器（太仓实验设备厂，中国）；多肽合成反应器（玻璃材质，自制）。

芥子气（购于防化学院，纯度>95%）；人血清白蛋白（Sigma，美国）；链酶蛋白酶（Pronase Type XIV from Streptomyces，E.C.3.4.24.31，Sigma，美国）；甲醇、乙腈（Merck，德国）；Wang树脂（南开大学化学系合成）；Fmoc-Pro-Phe-Wang Resin（实验室自己合成）；N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-羟基苯并三氮唑（HOBT）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）均来自苏州天马生化公司；半胱氨酸、哌啶、N-N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、三氟乙酸（TFA）、醋酸酐、1，4-二氧六环、无水硫酸镁等试剂均为国产分析纯试剂。实验室用水为：配置溶液所用水为实验室自制离子交换水。

1.2 标准品合成及鉴定

以树脂Fmoc-Pro-Phe-Wang Resin为固相载体，以20%哌啶N-N-二甲基甲酰胺混合液为脱保护剂，以等摩尔N，N-二环己基碳二亚胺（0.13 mg）、1-羟基苯并三氮唑（0.36 mg）混合溶液为缩合剂，与实验室自制半胱氨酸-半芥加合物（S-HETE）-Cys充分混匀后慢速搅拌4h，得到连接在树脂上目标多肽[4-6]：Fmoc-Cys（S-HETE） -Pro-Phe-Wang Resin。

脱去Fmoc保护后，以三氟乙酸∶水体积比为95∶5 混合液（15 mL）为裂解液，将多肽从树脂上切割下来，将裂解液倒入冰乙醚（30 mL）中，得到三肽加合物粗品约400 mg，经RP-HPLC纯化并冻干[5]，得目标产物[（S-HETE）-Cys-Pro-Phe]约100 mg左右，产率20%。

应用Agilent 1200 LC &6520 Q-TOF MS 四级杆飞行时间质谱仪对（S-HETE）-Cys-Pro-Phe标准溶液进行定性检测。图1所示为（S-HETE）- Cys-Pro-Phe总离子流图和选择离子图，以及质谱和二级质谱图。

通过全扫描质谱可确定质子化分子离子峰[M+H]+ （m/z 470），之后对分子离子峰[M+H]+进行MS/MS质谱分析，可确定各个碎片与该分子结构相对应，且与文献值相同[6]，进而证明合成所得确为目标产物。采用归一化法分析（S-HETE）-Cys-Pro-Phe标准溶液LC图，得到面积百分比为96.8%，即合成（S-HETE）-Cys-Pro-Phe纯度>96.8%。

图1 应用LC-Q-TOF测定（S-HETE）-Cys-Pro-Phe色谱、质谱及二级质谱图

1.3 样品处理

1.3.1 [（S-HETE）-Cys-Pro -Phe]标准溶液配制 准确称取5 mg[（S-HETE）-Cys-Pro-Phe]标准品于容量瓶中，加入5 mL含有0.02% TFA 40%乙腈水溶液，定容后标准溶液浓度为1 mg/mL。标准溶液在-4℃条件下可在30天内保持稳定。将（S-HETE）- Cys-Pro-Phe标准溶液稀释至0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，5μg/mL、10μg/mL，-20℃保存待测。

1.3.2 （S-HETE）-Cys-Pro-Phe提取[7-8] 采用C18固相萃取法分别从染毒人血清白蛋白样品和染毒人血样品中提取三肽加合物（S-HETE）-Cys-Pro-Phe。首先用1 mL甲醇淋洗固相萃取小柱，用1 mL双蒸水活化30min，将1 mL上述染毒血清白蛋白样品上柱，用双蒸水1 mL淋洗，除去杂质，再用40%乙腈水溶液3 mL洗脱三肽加合物（S-HETE）-Cys-Pro-Phe。收集洗脱液，以低于60℃温度离心浓缩除去溶剂，向旋干样品加入200μL 40%乙腈水溶液，超声震荡、待测。

1.4 样品分析

色谱条件：日本资生堂公司C18色谱柱（2.0×150mm， 5μm）；流动相A：95%水-5%乙腈（内含0.01%甲酸铵）；流动相B：95%乙腈-5%水（内含0.01%甲酸铵）；洗脱程序：0～1 min流动相B 10%；1～14 min流动相B从10%升至65%；14～15 min流动相B从65%升至90%；15～20 min流动相B降至10%；流速：0.2 mL/min，进样量：2μL；柱温：室温。

质谱条件：ESI源：正离子电离，源温120 ℃，脱溶剂温度350 ℃，毛细管电压3000 V，MCP 2700 V；EIC Scan m/z =470.1800，（误差±0.01）。

2 结果

2.1 （S-HETE）-Cys-Pro-Phe工作曲线绘制

将1.3.1中各浓度（S-HETE）-Cys-Pro-Phe标准溶液按1.4液相色谱-质谱条件进行定量测定，根据测定结果，以（S-HETE）-Cys-Pro-Phe标准溶液浓度为横坐标，提取离子色谱峰（470.18000）峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（如图2所示），结果表明（S-HETE）-Cys-Pro-Phe标准溶液线性范围为1～50μg/mL，回归方程为Y=4.797×103+1.568×106X，R=0.9967，检测限为2 ng/mL （S/N=3）。

2.2 芥子气染毒样本测定

将1.3.4中提取芥子气染毒血清及血液样本，按1.4液相色谱-质谱条件进行定性、定量测定。通过从样品提取离子显示色谱图中可检出其[M+H]峰，证明血清经链酶蛋白酶酶解，能够形成（S-HETE）-Cys-Pro-Phe，从而可用做芥子气染毒血样定性鉴定。

（S-HETE）-Cys-Pro-Phe离子峰 （470.1800）峰面积与芥子气染毒浓度呈线性关系（如图3所示），回归方程为Y=1.478×105+6.988×104X，R=0.9969，芥子气检出范围为1～100μmol/L，检测限为1μmol/L （S/N=50）。由此可根据（S-HETE）-Cys-Pro-Phe离子峰面积定量计算芥子气染毒浓度。

3 讨论

3.1 方法回收率

将芥子气染毒浓度为50μmol/L血清样本按1.3.2中所述方法操作，并在质谱检测前添加等体积10μg/mL浓度（S-HETE）-Cys-Pro-Phe标准溶液，根据（S-HETE）-Cys-Pro-Phe峰面积比值计算回收率，测定结果如图4所示，根据回收率=（加标试样测定值A-试样测定值B）/加标量C×100%，求得回收率为53%。

a： 芥子气染毒血清样本总离子流图

b： 添加（S-HETE）-Cys-Pro-Phe标液后染毒血清样本总离子流图

c： （S-HETE）-Cys-Pro-Phe标准溶液总离子流图

3.2 实验条件优化

考察4种从芥子气染毒血液样本中提取白蛋白不同方法，分别是乙腈沉淀白蛋白法、白蛋白盐析法、固相萃取法和HiTrap Blue HP亲和柱法，结果表明使用HiTrap Blue HP亲和柱从全血中提取血清、再经过固相萃取方法提取效率最好。

固相萃取过程考察不同浓度乙腈溶液对萃取效率影响，以及TFA加入对萃取效果影响，确定最终萃取条件为首先用纯水淋洗，除去杂质，再用40%乙腈洗脱方法。洗脱液中添加TFA，会使得淋洗时损失较多（S-HETE）-Cys-Pro-Phe，故而采取乙腈水溶液为萃取洗脱液。

虽然链酶蛋白酶推荐条件为pH=8～9，但在实验中发现体系pH值对（S-HETE）-Cys-Pro-Phe影响不显著，故反应体系选择在中性条件下进行。

4 结论

本文应用固相萃取-高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法建立芥子气染毒血样中生物标志物（S-HETE）-Cys-Pro-Phe分析检测方法，可应用于芥子气染毒血液样本定性、定量分析，结果较为准确、耗时较短、检测限较低。

参 考 文 献

[1] 丁日高.化学损伤医学防护[M].北京：军事医学科学出版社，2002.

[2] 欧阳子倩，王廷治.防化医学[M].上海：上海科技出版社，1985.

[3] D Noort，G hulst，LPA Jong，HP Benschop，Alkylation of human serum albumin by sulfur mustard invitro and vivo [J]. Chem. Res. Toxicol. 1999，12：715-721.

[4] MK Rao，M Sharma，SKRaza，DK Jaiswal，Synthesis characterzation and mass spectrometric analysis of cysteine and valine adducts of sulphur mustard [J]. Phosphorus，Sulfur and Silicon，2003，178：559-566.

[5] D Noort，A Fidder，AG Hulst，Woolfitt，D Ash，JR Barr，Retrospective detection of exposure to sulfur mustard，[J]. J Anal Toxicol，2004，28（5）：333-338.

[6] 黄惟德，陈长庆.多肽合成[M].北京：科学出版社，1985.

[7] D Noort，A Fidder，C Langelaan，AG Hulst，Retrospective detection of sulfur mustard exposure by MS analysis of adducts to albumin，[J].J Anal. Toxicol. 2008，32：25-30.

[8] Thong-Hiang Yeo，Mer-Lin Ho，Weng-Keong Loke，Development of a LC-multiple reaction monitoring procedure for concurrent verification of exposure to different form of mustard agent，[J].J Toxicol. 2008，32：51-56.