RhoC慢病毒干扰载体的构建及其对卵巢癌SKOV3细胞中RhoC mRNA表达的影响

王 珂，邹积艳，汪 丽，杜珍武，王俊容，叶 聪，潘 颖

（1.吉林大学中日联谊医院妇产科，吉林 长春 130033；2.吉林大学中日联谊医院研究生管理办公室，吉林 长春 130033；3.吉林大学第二医院中心实验室，吉林 长春 130041）

卵巢癌严重威胁女性身体健康，是女性三大恶性肿瘤之一，其发病率位于第2位，而其病死率却高居榜首。卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期患者的5年存活率约为20%［1－2］。卵巢癌的病因不明，发病机制复杂［3］，至今仍无特异性的指标可以用于卵巢癌的治疗和判断预后。近年来，肿瘤的基因治疗成为热点。国内外已有针对卵巢癌其他基因沉默的类似研究［4－5］，Clark等［6］研究首次明确并证实RhoC在肿瘤细胞转移过程中起重要作用。以往研究多以质粒为载体，转染效率低，本研究应用RNAi基因沉默技术，以卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，将组织特异性的RhoC mRNA有效地导入细胞中，沉默卵巢癌SKOV3细胞中的致病基因RhoC，抑制RhoC基因与蛋白的表达，从而使卵巢癌的基因治疗成为可能。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂及仪器 人卵巢癌SKOV3细胞、人胚肾293T细胞均保存于吉林大学中日联医院中心实验室。胎牛血清和DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司，丙酮酸钠、非必需氨基酸和Trizol购自美国Invitrogen公司，Lenti－PacTM HIV慢病毒表达包装试剂盒购自美国Gene Copoeia公司，两步法实时荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司。Mx3000P荧光定量PCR仪购自美国Stratagene公司，PCR扩增仪购自美国ABI公司。

1.2 细胞培养 SKOV3细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM高糖培养基中。用于包装慢病毒的人胚肾293T细胞培养于含10% 胎牛血清、1%丙酮酸钠和1%非必需氨基酸混合液的DMEM高糖培养基中，上述2种细胞均置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.3 RhoC基因RNA干扰慢病毒载体构建 根据人RhoC基因cDNA序列（GenBank NO：NM＿001042678.1）设计RNA干扰的靶序列，根据靶序列进行慢病毒载体构建。载体构建委托广州复能基因生物技术有限公司完成。

1.4 慢病毒载体包装 处于对数生长期的人胚肾293T细胞经消化重悬后，取1.5×106个细胞接种于培养皿，2d后将干扰RhoC质粒psiHIV－RhoC及阴性对照质粒psiHIV－NC分别按病毒包装说明书进行包装，收集24、48和72h时的上清液。经离心、过滤、浓缩后分装，存放于－80℃条件下备用。所收集的病毒分别为Lenti－shRhoC和Lenti－NC。

1.5 细胞分组及处理 将SKOV3细胞按每孔1×105接种于6孔板，分别取1mL浓缩病毒LentishRhoC和通用阴性对照Lenti－NC感染SKOV3细胞。48h后，倒置荧光显微镜下观察SKOV3细胞中绿色荧光蛋白表达。转染Lenti－shRhoC的细胞为干扰组（2个亚平行组：psiHIV－RhoC1组和psiHIV－RhoC2组），转染Lenti－NC的细胞为阴性对照组，未进行转染操作的细胞为空白对照组（SKOV3组）。

1.6 RT－PCR法检测 SKOV3细胞中RhoC mRNA的表达 采用Trizol试剂分别提取干扰组、阴性对照组和空白对照组SKOV3细胞中RhoC基因的总RNA，用逆转录试剂盒将RNA转化为cDNA，然后采用ABI7500fast荧光定量PCR仪进行扩增。按照两步法实时荧光定量试剂盒SYBR PrimeScript RT－PCR Kit说明书进行。PCR引物：RhoC基因上游引物，5′－ACCTGCCTCCTCATCGTCTTC－3′；下游引物，5′－CACCTGCTTGCCGTCCACC－3′；PCR产物片段长度为105bp。GAPDH 内参基因上游引物，5′－TGCACCACCAACTGCTTAGC－3′；下游引物，5′－GGCATGGACTGTGGTCATGAG－3′；PCR 产物片段长度为87bp。PCR反应体系20μL，反应条件：95℃、30s，95℃、5s，60℃、30s，共40个循环；95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s。RhoC mRNA的表达水平以2－ΔΔct法计算。

1.7 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。各组SKOV3细胞中RhoC－mRNA相对表达量以表示，组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 RhoC基因RNA干扰慢病毒载体构建 根据RhoC基因cDNA序列应用RNA干扰设计软件，设定RhoC基因干扰靶向序列为2条，第1条的序列为GACCTGCCTCCTCATCGTC，该序列起始点位于RhoC基因cDNA核苷酸序列的第387位核苷酸；第二条的序列为CGAACCGGATCAGTGC－CTT，该序列起始点位于RhoC基因cDNA核苷酸序列的第776位核苷酸；上述序列分别克隆入慢病毒 psiHIV－H1载体（图1），分别命名为psiHIV－RhoC1与psiHIV－RhoC2。

图1 psiHIV－H1载体构建图Fig.1 Diagram of construction of psiHIV－H1vector

2.2 包装慢病毒载体感染SKOV3细胞形态学阴性对照组SKOV3细胞按预期可见绿色荧光蛋白表达。经病毒感染的psiHIV－RhoC1和psiHIVRhoC2组SKOV3细胞中亦可见绿色荧光蛋白的表达，表明Lenti－shRhoC慢病毒包装成功，并能作为干扰载体整合于靶细胞SKOV3的基因组，而空白对照组SKOV3细胞中未见绿色荧光蛋白表达。见图2（插页四）。

2.3 各组SKOV3细胞中RhoC mRNA表达水平psiHIV－RhoC1组SKOV3细胞中RhoC mRNA表达水平（0.006）比空白对照组（1.000）降低，psiHIV－RhoC2组SKOV3细胞中RhoC－mRNA表达水平（0.040）比空白对照组降低。见图3（插页五）。

3 讨 论

RhoC是Rho基因家族中的一员，能够参与肿瘤细胞多项重要的生命活动，如调节肌动蛋白骨架、参与细胞信号转导和细胞增殖等。其在恶性肿瘤中的高表达与肿瘤的迁移和侵袭有密切关联［7－8］。siRNA的生成是RNAi技术的关键点。体外制备转染效率虽然高，但是极易降解，难以长期发挥干扰作用。目前常用质粒作为载体［9－11］，虽然克服了易降解的缺点，但是转染效率却不尽如人意。所以本实验选用了近年来新兴的载体—慢病毒，其不易降解，同时转染效率较质粒高，能够稳定地在细胞中发挥作用，且能作用于哺乳动物，感染分裂细胞和非分裂细胞，激发外源基因的表达，是基因治疗比较理想的工具。

本研究采用慢病毒作为载体通过RNA干扰技术建立了RhoC基因稳定低表达的卵巢癌SKOV3细胞株，转染psiHIV－Rhoc的SKOV3细胞中RhoC mRNA的表达水平较空白对照组显著降低，这使得卵巢癌的基因治疗更具可能性。

综上所述，本研究通过包装慢病毒LentishRhoC，建立了慢病毒介导的RhoC基因稳定沉默卵巢癌SKOV3细胞株，通过实时荧光定量PCR法，证实构建的慢病毒载体能够高效地阻断卵巢癌SKOV3细胞中致病基因RhoC mRNA的表达，为卵巢癌基因治疗的进一步研究奠定了基础。

［1］Bendoraite A，Knouf EC，Garg KS.Regulation of miR－200 family microRNAs and ZEB transcription factors in ovarian cancer：evidence supporting a mesothelial－to－epithelial transition ［J］.Gynecol Oncol，2010，116（1）：117－125.

［2］Marchini S，Cavalieri D，Fruscio R，et al.Association between miR－200cand the survival of patients with stage I epithelial ovarian cancer：a retrospective study of two independent tumour tissue collections ［J］.Lancet Oncol，2011，6（2）：273－285.

［3］Kurman RJ，Shihe IM.The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer：A proposed unifying theory ［J］.Am J Surg Pathol，2010，34（3）：433－443.

［4］罗建桥，鲍春晓，周建维.miR－126调控SKOV3卵巢癌细胞周期的实验研究 ［J］.中国医药导报，2014，37（19）：21－23，27.

［5］刘 娜，曾 洁，张小媚，等.miR－200a参与调控卵巢癌化疗敏感性的作用及其机制 ［J］.中华医学杂志，2014，94（27）：2148－2151.

［6］Clark EA，Golub TR，Lander ES，et al.Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC ［J］.Nature，2000，406（6840）：532－535.

［7］郑建坤.RhoC及其与肿瘤作用的研究进展 ［J］.国际泌尿系统杂志，2013，33（3）：379－382.

［8］郁玲玲.Rho亚家族在肿瘤侵袭中的作用研究进展 ［J］.复旦学报：医学版，2010，37（5）：617－619.

［9］江若安，叶 枫，王新宇，抑制TUBA1C的过表达在卵巢癌细胞株CAOV3、SKOV3细胞增殖侵袭中的作用机制探讨 ［J］.浙江医学，2014，32（8）：644－647.

［10］范 钰，徐 娟，周永静，等.RNA干扰下调叉头转录因子M1基因对人肿瘤细胞生长、克隆和侵袭的影响 ［J］.中华实验外科杂志，2014，31（7）：1543－1546.

［11］李 圃，李冬田，尹冰楠，等.融合基因CDglyES重组腺病毒对卵巢癌细胞抑制作用的体外研究 ［J］.中国肿瘤临床，2014，35（13）：861－865.