白藜芦醇对喉癌Hep－2细胞顺铂敏感性的增强作用及其机制

战仕花，王 苹，尹万忠，祝 威

（吉林大学第一医院耳鼻咽喉－头颈外科，吉林 长春 130021）

目前顺铂（cisplatin，DDP）已经应用于多种肿瘤的一线联合化疗方案中，但其具有肾毒性、消化道毒性、骨髓抑制和耳毒性等不良反应［1］，因此其用量及联合配伍受到限制。白藜芦醇（resveratrol，Res）具有抗肿瘤、抗炎、肝脏保护、神经保护、心血管保护和免疫调节等多种生物学活性，其中最具研究前景的是其抗肿瘤效应［2］。目前研究［3－6］显示：白藜芦醇具有激活sirtuin，降低DDP引起的肾毒性、耳毒性和心脏损伤等的作用。沉默信息调节因子2（silent information regulator 2，Sir2）相关酶1（Sirt1）是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotin－amide adenine dinucleotide，NAD）的去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），Sirt1与多种细胞生物学功能有关联，在肿瘤的发生发展中具有重要的作用［7］。sirtuins是在哺乳动物中发现的Sir2的同源物，其中Sirt1是研究较深入的一个成员。Sirt1以许多非组蛋白和组蛋白为底物，与多种细胞生物学功能如基因转录沉默、细胞生长周期调节等有密切关联，Sirt1作为治疗不同疾病的靶点逐渐被人们重视，Sirt1不仅参与了其寿命的调节，而且在肿瘤的发生发展中具有非常重要的作用［8］。但在许多肿瘤细胞中其作用仍存在争议。Sirt1在多种恶性肿瘤中存在过表达的情况，作为肿瘤促进因子［9］。Sirt1在部分恶性肿瘤如胶质母胞瘤中表达水平有所降低［10］。Wang等［11］发现：Sirt1的表达水平在许多其他类型肿瘤中降低，包括胶质母细胞瘤、膀胱癌前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肝癌等，Sirt1在这些组织中起肿瘤抑制因子作用而非肿瘤促进因子的作用。有研究［12］显示：白藜芦醇增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，目前尚未有研究将白藜芦醇和DDP联合应用于喉癌细胞。本实验拟采用白藜芦醇联合DDP作用于喉癌细胞，观察白藜芦醇对DDP化疗的增敏作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 人喉鳞状细胞癌Hep－2细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所提供。RPMI 1640培养基和胰蛋白酶（美国Gibco公司），Triton X－100、白藜芦醇、DDP（美国Sigma公司），sirtinol（美国Cayman公司），Sirt1多克隆抗体（北京博奥森公司），CCK－8、Annexin VFITC Kit（碧云天生物研究所）。超净工作台JDJ－203（苏州净化设备厂），CO2培养箱（日本SANYO公司），BX50荧光显微镜、FV1000型激光共聚焦荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 细胞培养及分组人喉鳞状细胞癌 Hep－2细胞株培养在含10%胎牛血清、100U·mL－1的青霉素和100U·L－1的链霉素1640培养基中，在饱和温度、37℃、5%CO2孵箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化传代。当细胞生长处于对数生长期时，将细胞接种于96孔板、9.6cm2小皿和圆形载玻片。细胞分为空白对照组和DDP组（3、6、12和24μmol·L－1），选出DDP的最佳浓度用于以下分组。对照组、DDP组、白藜芦醇组、sirtinol组、白藜芦醇＋sirtinol组、白藜芦醇＋DDP组、sirtinol＋DDP组、白藜芦醇＋sirtinol＋DDP组。白藜芦醇＋sirtinol组细胞加药时先加白藜芦醇，1h后加DDP；白藜芦醇＋DDP组和sirtinol＋DDP组细胞加药时先加白藜芦醇或sirtinol，1h后加DDP；白藜芦醇＋sirtinol＋DDP组加药时先加白藜芦醇，1h后加sirtinol，再过1h后加DDP。最终药物的作用浓度为：白藜芦醇50μmol·L－1，sirtinol 40 μmol· L－1，DDP 6μmol·L－1。

1.3 CCK－8法检测细胞生存率 选对数生长期细胞用胰酶消化后，铺于96孔板内，CO2培养箱培养24h至细胞密度为80%后加药；CO2培养箱培养24h；在超净台中将96孔板中培养基换为不含血清及抗生素的1640培养基100μL，然后加入CCK－8试剂10μL；37℃孵育2h；在酶标仪450nm处检测吸光度（A）值，计算细胞生存率。细胞生存率＝（实验组A值－空白组A值）／（对照组A值－空白组A值）×100%。

1.4 免疫荧光法检测细胞中Sirt1蛋白表达 选对数生长期细胞用胰酶消化后，铺于圆形载玻片并标记，待细胞密度达40%时加药。室温下4%多聚甲醛溶液固定30min，PBS漂洗3次，每次5min；加入1%Triton X－1001.5mL打孔10min后，PBS漂洗3次，每次5min；滴加5%山羊血清，于室温下放置1h；加入Sirt1抗体（1∶100），4℃孵育过夜；0.1mol·L－1PBS在摇床上漂洗3次，加入Alexa 488绿色山羊抗兔抗体（1∶200稀释），室温避光静置1h；0.1mol·L－1PBS漂洗3次，每次5min；90%甘油封片，荧光显微镜进行观察，拍照。图像中的绿色荧光显示Sirt1蛋白表达阳性，随机取3个视野用激光共聚焦荧光显微镜检测平均荧光强度。荧光强度越强提示Sirt1蛋白表达越多。

1.5 Annexin V－FITC Kit法检测细胞凋亡率 选对数生长期细胞用胰酶消化后，铺于小皿中并标记，待细胞密度达80%时加药。加药培养步骤同CCK－8中的加药步骤。移去培养基后用 Hank’s液洗涤；查细胞数，胰酶消化；加1×binding Buffer 1mL，300g离心10min，移去上清，加入1×binding Buffer 100μL重悬细胞；加10μL Annextin V－FITC，混匀后室温下孵育15min；加1×binding Buffer 1mL，300g离心10min，移去上清。加入1×binding Buffer 500μL重悬细胞；加入5μL PI solution立即进行铺片，应用荧光显微镜进行观察，拍照。绿色荧光显示早期的细胞凋亡，红色荧光显示晚期的凋亡和坏死细胞。细胞凋亡率＝同一视野下凋亡细胞数／细胞总数×100%。

1.6 统计学分析 采用Graphpad Prism统计软件进行统计学分析。细胞生存率、平均免疫荧光强度和细胞凋亡率以表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组Hep－2细胞的生存率 CCK－8法检测6、12、24和48h各组Hep－2细胞生存率，与空白对照组比 较，12、24和48h 时，6、12、24μmol·L－1DDP组细胞生存率明显下降（P＜0.05或P＜0.01），见表1。CCK－8检测细胞生存率，与对照组比较，DDP组（78.42%）、白藜芦醇组（87.35%）、白藜芦醇＋DDP组（69.53%）、sirtinol＋DDP组（86.77%）和白藜芦醇＋sitinol＋DDP组（81.69%）细胞生存率明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。与DDP组比较，白藜芦醇＋DDP组细胞生存率明显下降（P＜0.01）。与白藜芦醇＋DDP组比较，白藜芦醇＋sirtinol＋DDP组细胞生存率明显降低（P＜0.05）。见表2。

表1 不同时间点和DDP浓度各组Hep－2细胞生存率Tab.1 Survival rates of Hep－2cells in various groups treated with different concentrations of DDP at different time points（n＝3，，η／%）

表1 不同时间点和DDP浓度各组Hep－2细胞生存率Tab.1 Survival rates of Hep－2cells in various groups treated with different concentrations of DDP at different time points（n＝3，，η／%）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with blank control group.

6 12 24 48 Blank control 100.00±0.00 100.00±0.00 100.0 Group Survival rate（t／h）0±0.00 100.00±0.00 DDP（μmol·L－1）3 98.81±2.06 98.38±2.70 98.58±7.40 92.48±5.76 100.24±1.81 92.08±0.39＊ 89.08±4.30＊＊ 80.28±2.2＊＊12 97.63±2.34 85.61±1.20＊＊ 82.42±7.07＊＊ 82.97±1.45＊＊24 97.75±2.28 80.77±5.15＊＊ 59.87±4.95＊＊ 47.60±5.15＊＊

2.2 各组Hep－2细胞中Sirt1蛋白表达强度 与对照组比较，白藜芦醇组、DDP组和白藜芦醇＋DDP组细胞中Sirt1蛋白平均免疫荧光强度均明显升高（P＜0.01）。与白藜芦醇＋sirtinol组比较，白藜芦醇组细胞中Sirt1蛋白平均免疫荧光强度明显升高（P＜0.01）。与sirtinol＋DDP组比较，DDP组细胞中Sirt1蛋白平均免疫荧光强度明显升高（P＜0.01）。与 DDP组比较，白藜芦醇＋DDP组细胞中Sirt1蛋白平均免疫荧光强度明显升高（P＜0.01）。与白藜芦醇＋sirtinol＋DDP组比较，白藜芦醇＋DDP组细胞中Sirt1蛋白平均免疫荧光强度明显升高（P＜0.01）。见图1（插页三）和表3。

表2 各组Hep－2细胞生存率Tab.2 Survival rates of Hep－2cells in various groups（n＝3，，η／%）

表2 各组Hep－2细胞生存率Tab.2 Survival rates of Hep－2cells in various groups（n＝3，，η／%）

＊P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs DDP group；#P＜0.05 vs sirtinol＋DDP group.

Group Survival rate Control 100.00±0.00 DDP 78.42±1.35＊Resveratrol 87.35±1.25＊Resveratrol＋DDP 69.53±0.45＊△Sirtinol＋DDP 86.77±1.76＊Resveratrol＋sirtinol＋DDP 81.69±6.33＊#

表3 各组Hep－2细胞中Sirt1蛋白的平均免疫荧光强度Tab.3 Mean fluorescence intensities of Sirt1protein in Hep－2cells in various groups （n＝3，）

表3 各组Hep－2细胞中Sirt1蛋白的平均免疫荧光强度Tab.3 Mean fluorescence intensities of Sirt1protein in Hep－2cells in various groups （n＝3，）

＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.01compared with DDP group；#P＜0.01compared with resveratrol group；▲P＜0.01compared with resveratrol＋DDP group.

Group Mean fluorescence intensit y Control 103.73±10.65 DDP 134.30±12.65＊Resveratrol 200.67±21.35＊Resveratrol＋DDP 169.90±14.93＊△#Sirtinol 87.07±4.93 Sirtinol＋DDP 111.43±5.61△Resveratrol＋sirtinol 108.07±5.34#Resveratrol＋sirtinol＋DDP 127.70±13.37##▲

2.3 各组细胞凋亡率 与对照组（4.39%±0.65%）比较，白藜芦醇＋DDP组细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）。与DDP组（12.89% ±0.56%）比较，白藜芦醇＋DDP组细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）。与白藜芦醇组比较，白藜芦醇＋DDP组细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）。与白藜芦醇＋DDP＋sirtinol组（12.37%±0.99%）比较，白藜芦醇＋DDP组细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）。见图2（插页三）。

3 讨 论

临床上喉癌的化疗以应用DDP为主，本研究中CCK－8实验的检测结果也提示DDP可抑制Hep－2细胞的生长，促进 Hep－2细胞的凋亡。DDP在抗肿瘤作用的同时，同样表现出肾毒性、耳毒性、神经毒性和骨髓抑制的不良反应［1］。Lee等［13］研究发现：DDP与耳蜗组织结合后可激发产生大量的自由基，诸如超氧化物、过氧化氢等，进而引起内耳损伤。王黎等［14］研究发现：DDP引起肾毒性的发病机制主要与氧化应激机制有关联。DDP的毒性限制其在临床化疗中的应用，针对降低DDP毒性作用的联合化疗方案仍有待开发。

白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄、虎杖和花生等多种植物中的多酚化合物，是植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌、病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒素。白藜芦醇具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤作用，也有抗心血管疾病、抗炎、免疫调节和抗衰老等生物学作用。在肝癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌和白血病等多种肿瘤细胞中白藜芦醇均有显著抑制肿瘤的作用［15］。白藜芦醇有抗肿瘤作用，可减少DDP引起的大鼠心脏毒性、内耳损伤和肾毒性［4－6］。Björklund等［16－18］研究发现：白藜芦醇也能提高卵巢上皮癌细胞对顺铂的敏感度。本研究结果显示：白藜芦醇可抑制喉癌Hep－2细胞生长，促进喉癌Hep－2细胞凋亡。

Sirt1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，白藜芦醇具有激活Sirt1的作用［3］。Sirt1以组蛋白和非组蛋白为底物进行去乙酰化，参与多种细胞生物学功能如基因转录沉默、细胞生长周期调节等。本研究中细胞免疫荧光检测结果显示：喉癌Hep－2细胞中表达Sirt1蛋白，白藜芦醇作用后Hep－2细胞中Sirt1蛋白过表达，DDP也能提高喉癌Hep－2细胞中Sirt1蛋白的表达，白藜芦醇和DDP联合应用后Hep－2细胞中Sirt1蛋白过表达。DDP和白藜芦醇抑制Hep－2细胞增殖和促进凋亡作用可能部分是由Sirt1蛋白表达增加引起。

综上所述，DDP在抗肿瘤作用的同时，表现出的肾毒性、耳毒性、神经毒性、心脏毒性和骨髓抑制等不良反应限制其临床应用。本研究结果显示：与单独使用DDP比较，白藜芦醇与DDP联合作用时Hep－2细胞生长明显被抑制，细胞凋亡明显增加，提示白藜芦醇增加了Hep－2细胞对DDP的敏感性，其机制可能与白藜芦醇提高Hep－2细胞中Sirt1蛋白表达，导致Hep－2细胞对DDP的敏感性增加有关。本研究可能为喉癌的化疗提供新思路、新线索和新方法。

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