载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞中糖原合成酶激酶3β表达的研究

张娜，刘璐，窦玥莹，王真，宋丹青，李电东，邓洪斌

载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞中糖原合成酶激酶3β表达的研究

张娜，刘璐，窦玥莹，王真，宋丹青，李电东，邓洪斌

目的 构建和筛选能高效、特异性抑制人 GSK-3β基因表达的 siRNA表达载体，探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。

方法 提取人 L02细胞总 RNA，RT-PCR扩增 GSK-3β基因序列，克隆至 pSEB-HUS真核表达载体，构建 pSEB-G重组质粒。将设计、合成的 3条靶向 GSK-3β基因编码区的siRNA及阴性对照分别克隆至pSEB-G，构建siRNA表达载体 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及 pSEB-siN-G。将 siRNA表达载体瞬时转染 HepG2细胞，通过绿色荧光信号、RT-PCR和 Western blot观察和检测其对 GSK-3β基因的抑制效果，MTT实验和 caspase-3活性分析检测其对 HepG2细胞增殖和凋亡的影响。

结果 经双酶切及测序证实，所构建 siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。瞬时转染 HepG2细胞后，其中的 pSEB-si1-G能使细胞中绿色荧光信号明显减少，可显著抑制 GSK-3β mRNA的表达及蛋白的合成，并使 HepG2细胞增殖明显降低，caspase-3活性显著升高。

结论 成功构建了靶向 GSK-3β基因的 siRNA表达载体，沉默 GSK-3β能显著抑制 HepG2细胞的生长并诱导其发生凋亡。

糖原合成酶激酶 3β； RNA干扰； 癌，肝细胞； siRNA表达载体

糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，在肝细胞等真核细胞中广泛存在，于 20世纪 70年代末被发现和鉴定［1-2］。GSK-3β定位于染色体 3q13.3，主要由氨基端、激酶区和羧基端 3个结构域组成，其参与胰岛素、Wnt、Hedgehog以及Notch等多种信号传导通路，在调控细胞的增殖、分化、凋亡以及肿瘤发生等方面都发挥重要作用［3］。GSK-3β活性的紊乱促进包括肿瘤在内的多种疾病的发生和发展［4-5］。

研究发现，GSK-3β在多种肿瘤中具有促进肿瘤生长的作用。如在 90%肾癌细胞核中发现存在GSK-3β的异常聚集，抑制 GSK-3β活性后可显著降低肾癌细胞的增殖与存活［6］。GSK-3β还可促进急性骨髓性白血病（AML）的发生［7］。在胰腺癌中也存在 GSK-3β的高表达，其通过激活 IKK-NF-κB通路促进胰腺癌细胞的存活［8］。因此，GSK-3β已成为众多肿瘤防治的一个新靶标［9］。

目前有关 GSK-3β在肝癌发生发展中的作用还不明确。本实验拟通过构建、设计抑制 GSK-3β基因表达的 siRNA载体，在肝癌细胞 HepG2中表达靶向 GSK-3β的 siRNA分子，观察不同siRNA分子对 GSK-3β的抑制效果及其对肝癌细胞增殖能力和凋亡的影响，初步探讨 GSK-3β在肝癌形成中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和细胞 pSEB-HUS siRNA表达载体（图 1）［10］由美国芝加哥大学 Tong-chuan He教授惠赠。大肠杆菌 DH5α、人正常肝细胞 L02、肝癌细胞株 HepG2由本实验室保存。

图1 siRNA表达载体构建示意图Figure 1 Schematic diagram of siRNA expression vector construction

1.1.2 主要试剂 细胞总 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒等购自大连宝生物公司；DMEM高糖培养基和胎牛血清购自美国 Hyclone公司；caspase-3底物 DEVD-AFC、GSK-3β抗体、β-actin抗体和羊抗兔或小鼠二抗购自美国 Santa Cruz公司；GenEscort II转染试剂购自南京慧基生物技术有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；ECL Plus超敏免疫印迹检测试剂盒购自美国 Bio-Rad公司；MTT购自美国 Sigma公司；β-半乳糖苷酶检测试剂盒购自美国 Promega公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器 Berthold LB942荧光检测仪为德国伯托公司产品；ChemiImager 5500凝胶成像系统为美国 Alpha公司产品。

1.2 方法

1.2.1 人 GSK-3β基因的扩增

1.2.1.1 细胞总 RNA的提取 收集人正常肝细胞 L02，裂解后用细胞总 RNA抽提试剂盒提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳，–80℃ 保存。

1.2.1.2 RT-PCR 根据 GenBank中人 GSK-3β基因序列（NM_001146156），设计正向和反向引物，其中正向引物含 Bgl II酶切位点（5'GAAGATCTA TGTCAGGGCGG CCCAGAACCA 3'）、反向引物含Xho I酶切位点（5'CCGCTCGAGTCAAGTGGAG TTGGAAGCTGATGC 3'）。按照 Takara RNA PCR试剂盒说明进行 RT-PCR，逆转录条件为：37℃15 min，85℃5 s；PCR条件为：94℃ 变性 45 s，58℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 2 min，共 30个循环。1%琼脂糖凝胶电泳观察后胶回收 1263 bp基因片段。

1.2.2 真核表达载体 pSEB-G的构建 用 Bgl II、 Xho I双酶切 PCR胶回收产物和真核表达载体pSEB-HUS，酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后胶回收，T4 DNA连接酶 18℃ 连接 3 h，转化感受态 DH5α大肠杆菌，氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，双酶切鉴定正确后送上海生物工程公司测序。阳性克隆载体命名为 pSEB-G。

1.2.3 siRNA真核表达质粒载体的构建

1.2.3.1 siRNA序列设计 利用 Ambion siRNA靶序列分析设计系统，分析人 GSK-3β基因的编码区（NM_001146156）序列，依据 siRNA靶序列设计原则，经 BLAST同源性分析，选择确定 3对靶序列，同时设计 1对阴性对照序列，由上海生物工程公司合成。设计的 siRNA及阴性对照序列见表1。

1.2.3.2 siRNA表达载体构建 将合成的 siRNA片段用 ddH2O配成终浓度为 1 μg/μl，100℃ 煮沸5 min后室温下慢慢冷却使之退火，再与经 Sfi I酶切的 pSEB-G质粒进行连接，进而分别将siRNA片段克隆进 pSEB-G载体中，经转化和氨苄青霉素抗性筛选后，用菌落 PCR的方法挑取阳性克隆：5'端使用H1（CCAGCTTAATTCGAACGC TGACGT）引物，3'端使用 sense siRNA引物，PCR条件为：94℃ 变性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30个循环。菌落 PCR鉴定的阳性克隆质粒送上海生物工程公司测序，分别命名为pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G、pSEB-siN-G（阴性对照质粒）。

表1 3对 GSK-3β siRNA和阴性对照 siRNA序列Table 1 Sequences of three GSK-3β siRNAand one negative control

1.2.4 siRNA表达载体转染细胞 将 HepG2细胞接种于 6孔板，当细胞密度达 70%～80%时进行转染。将 6 μl GenEscort II转染试剂与 100 μl PBS混合，再将 1 μg siRNA表达载体与 100 μl PBS混合，然后将上述两种溶液轻轻混匀，室温放置 15 min后，加入到每孔含 400 μl DMEM 培养基的 6孔板中，37℃、5%CO2培养 6 h后，改用含10%FBS的新鲜DMEM培养基，连续培养48～72 h。

1.2.5 最佳 siRNA表达载体的筛选 分别将pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及pSEB-siN-G质粒与 pCMV-β-galactosidase质粒用 GenEscort II共转染至对数生长期的 HepG2细胞，72 h后置荧光显微镜下观察荧光表达情况。为定量检测 GFP蛋白的荧光变化，将转染后的细胞裂解后用荧光检测仪进行测定，同时测定其 β-半乳糖苷酶活性，各孔的荧光数值与 β-半乳糖苷酶活性的比值即为GFP的荧光强度。

1.2.6 RT-PCR检测 GSK-3β mRNA水平变化 收集转染 72 h的细胞，用 Trizol试剂提取总 RNA。逆转录：取 HepG2细胞总 RNA 2 μg，oligo（dT）18引物 2 μl，DEPC水补足至 12.5 μl，70℃ 温育5 min，冰上冷却后依次加入 5×缓冲液 5 μl、2.5 μl 10 mmol/L dNTP、M-MLV逆转录酶 1 μl，42℃ 温育 60 min，进行 cDNA第一链的合成，95℃5 min终止反应。PCR：以 β-actin作为内参对照，检测GSK-3β基因表达水平变化。GSK-3β上游引物：5'ATTTCCAGGGGATAGTGGTGT 3'，下游引物：5'GGTCGGAAGACCTTAGTCCAAG 3'；β-actin上游引物：5'GGCTGTATTCCCCTCCATCG 3'，下游引物：5'CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 3'。

1.2.7 Western blot 将细胞用细胞刮刀刮下，1200×g离心收集细胞。加入适量裂解液（50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、1%Triton-100、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、1 mmol/L NaVO3、50 mmol/L NaF、1 mmol/L PMSF、1 mg/ml抑肽酶、1 mmol/L亮抑酶肽），冰浴 30 min后，14 000×g离心 15 min，收集上清即为蛋白提取液。用标准 Bradford方法测定样品的蛋白浓度。于 12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干法将蛋白转至 PVDF膜。转膜结束后，将其放入含 5%脱脂奶粉的 TBST （20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.1%吐温-20，pH 7.6）中振荡封闭 1 h，再与 GSK-3β或β-actin一抗溶液（1∶1000稀释）4℃ 孵育过夜，之后用 TBST洗膜 3次，与辣根过氧化物酶标记的二抗溶液（抗兔二抗 1∶2000稀释、抗鼠二抗1∶5000稀释）在室温孵育 1～2 h后，TBST洗膜3次，按照 ECL Plus免疫试剂盒说明书进行显色，通过 ChemiImager 5500凝胶成像系统捕获并分析图像。

1.2.8 MTT法检测 HepG2细胞增殖的变化 取对数生长期 HepG2细胞制备单细胞悬液，以 6× 103个/孔细胞密度接种于 96孔板，每组设置 6个复孔，同时设空白对照（仅加培养液）。待细胞密度达到 50%左右，转染相应的 siRNA表达质粒，分别于转染 1～5 d后，每孔加入 20 μl（5 mg/ml）MTT溶液，继续培养 4 h，每孔加入 150 μl DMSO，振荡 10 min，使紫色结晶充分溶解，酶标仪检测各孔吸光度（A570）值。

1.2.9 caspase-3活性分析检测 HepG2细胞凋亡的变化 按照本实验室发表的方法［11］检测细胞中caspase-3的活性。HepG2细胞转染相应的 siRNA表达质粒 72 h后，收集细胞。加入细胞裂解液冰浴 30 min后，14 000×g离心 15 min收集上清。分别将 50 μg上清与 10 μg DEVD-AFC底物加到 1 ml反应液（12 mmol/L HEPES、2.5 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT和 0.1%CHAPS）中，37℃温育 2 h后，荧光光度计读取相应数值，激发波长400 nm 和发射波长 505 nm 读数的比值代表caspase-3活性。

1.3 统计学处理

每次试验至少重复 3次，实验结果采用 t检验进行统计分析，各组数据采用± s 表示，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSK-3β RT-PCR扩增结果

提取 L02细胞总 RNA，进行 RT-PCR，扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后，在约 1263 bp处呈现特异性目的条带，与人 GSK-3β基因的编码区大小相符（图 2）。

图2 人 GSK-3β基因的 RT-PCR结果Figure 2 RT-PCR result of human GSK-3β

2.2 pSEB-G重组质粒的构建及鉴定

重组 pSEB-G质粒经 Bgl II、Xho I双酶切后，得到 1条约 1263 bp的目的条带及线性空载体条带，而空载体 pSEB-HUS经双酶切后仅有一条线性条带（图 3）。此外，重组 pSEB-G质粒靶基因的测序结果与 GenBank中人 GSK-3β基因序列（NM_001146156）完全一致。以上结果表明，含人 GSK-3β基因的重组质粒 pSEB-G构建成功。

图3 pSEB-G重组质粒的 Bgl II、Xho I双酶切鉴定结果Figure 3 Bgl II and Xho I double digestion result of recombinant plasmid pSEB-G

A：pSEB-si1-G；B：pSEB-si2-G；C：pSEB-si3-G；D：pSEB-siN-G

2.3 siRNA表达载体的构建

将合成好的 siRNA退火后，与 Sfi I酶切后的pSEB-G质粒进行连接，转化 DH5α，挑取克隆进行菌落 PCR，对菌落 PCR出现目的条带的克隆进行 DNA序列测定，均得到与设计一致的阳性克隆（图 4）。表明靶向 GSK-3β的 siRNA表达载体pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G以及阴性对照载体 pSEB-siN-G构建成功。

2.4 siRNA表达载体转染 HepG2细胞后 GFP绿色荧光蛋白的表达差异

分别将 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G、pSEB-siN-G和 pSEB-G质粒用 GenEscort II瞬时转染 HepG2细胞，72 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，并定量检测 GFP荧光强度的变化（图 5）。结果表明，与对照组相比，pSEB-si1-G转染组的绿色荧光信号（31.6%）明显弱于其他组，pSEB-si3-G转染组的绿色荧光信号（62.7%）也有所减弱，而 pSEB-si2-G转染组的绿色荧光信号（84.2%）则变化不大，说明 pSEB-si1-G 对 GSK-3β的干扰效果最好。

A：分别将等量的 pSEB-G、pSEB-siN-G、pSEB-si1-G、pSEB-si2-G或 pSEB-si3-G质粒转染 HepG2细胞，72 h后荧光显微镜观察 siRNA对 GFP蛋白表达的抑制情况；B：将等量的 pSEB-G、pSEB-siN-G、pSEB-si1-G、pSEB-si2-G或 pSEB-si3-G质粒与 pCMV-β-galactosidase质粒共转染HepG2细胞，72 h后裂解并收集细胞，定量测定荧光强度，各孔的转染效率用 β-半乳糖苷酶活性进行检测（*P＜0.05）A:HepG2 cells were transfected with an equal amount of pSEB-G，pSEB-siN-G，pSEB-si1-G，pSEB-si2-G or pSEB-si3-G plasmids，the inhibition of GFP expression by siRNAs was recorded at 72 h under a fluorescence microscope；B:HepG2 cells were transfected with an equal amount of pSEB-G，pSEB-siN-G，pSEB-si1-G，pSEB-si2-G or pSEB-si3-G plasmids，along with pCMV-β-galactosidase.At 72 h，the transfected cells were lyzed and subjected to fluorescence measurement.Transfection efficiency was normalized with β-galactosidase activity（*P＜0.05）

2.5 siRNA对 GSK-3β mRNA和蛋白的影响

RT-PCR结果表明，转染 siRNA表达载体的HepG2细胞中 GSK-3β mRNA的表达均受到不同程度抑制（图 6A）。其中 pSEB-si1-G转染组的抑制效果最强，达到几乎完全抑制的效果；pSEB-si3-G转染组也有抑制作用；pSEB-si2-G转染组的抑制效果最差。而阴性对照组和转染空载体的 HepG2细胞中都存在较高水平的 GSK-3β mRNA表达。

Western blot结果表明，转染空载体和阴性对照组的 HepG2细胞中 GSK-3β蛋白呈现高表达，GSK-3β蛋白印迹出现在 47 kD处，与人 GSK-3β相对分子质量一致；而转染 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G 和 pSEB-si3-G的实验组细胞中，GSK-3β蛋白的表达均受到抑制（图 6B）。其中 pSEB-si1-G的抑制作用要优于其他两个，GSK-3β蛋白的表达下降90% 以上。以上结果说明 pSEB-si1-G为可高效抑制 GSK-3β mRNA和蛋白表达的 siRNA表达载体。

图6 不同 siRNA对 GSK-3β的干扰效果Figure 6 Knockdown efficiency of siRNAs on GSK-3β

2.6 干扰GSK-3β的表达能有效抑制 HepG2细胞的增殖

将靶向 GSK-3β的 siRNA表达质粒转染细胞后，用 MTT法检测细胞增殖情况，用酶联免疫检测仪检测各孔的吸光度，以时间作为横坐标，吸光度值作为纵坐标绘制生长曲线。结果显示：与对照组细胞相比，转染 pSEB-si1-G和 pSEB-si3-G的实验组细胞的增殖均受到抑制，其中 pSEB-si1-G组的抑制作用要优于 pSEB-si3-G组（图 7）。

图7 GSK-3β siRNA对 HepG2细胞增殖的影响（*P＜0.05）Figure 7 Effect of GSK-3β siRNAs on HepG2 cell proliferation（*P＜0.05）

2.7 干扰 GSK-3β的表达可诱导 HepG2细胞凋亡的发生

caspase家族在介导细胞凋亡的过程中发挥非常重要的作用，其中 caspase-3为关键的执行分子。caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活并最终导致细胞凋亡，但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞中，caspase-3的活性明显下降。将表达 pSEB-si1-G、pSEB-si3-G和 pSEB-siN-G的 siRNA表达质粒转染 HepG2细胞后，收集细胞检测 caspase-3活性的变化。结果显示，与对照组相比，转染 pSEB-si1-G、pSEB-si3-G 组 HepG2细胞中 caspase-3活性均上升，其中pSEB-si1-G组上升更为明显，说明 pSEB-si1-G可显著诱导 HepG2细胞发生凋亡（图 8）。

图8 GSK-3β siRNA对 HepG2细胞 caspase-3活性的影响（*P＜0.05）Figure 8 Effect of GSK-3β siRNAs on the caspase-3 activity of HepG2 cell（*P＜0.05）

3 讨论

RNA干扰（RNAi）是指内源性或外源性双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）导致细胞内同源mRNA发生特异性降解的过程［12］。RNAi作为一种新型的基因沉默工具，因其具有高效性、高特异性和低毒性等优点，已成为从基因到功能的反向遗传学研究的热门首选。小分子干扰 RNA （siRNA）的制备方法包括化学合成、体外合成、RNase III酶切 dsRNA、siRNA表达载体以及siRNA表达框架，不同方法适合不同的研究方法和目的。其中 siRNA表达载体法可以在细胞中持续抑制靶基因的表达［13］，已逐渐成为进行 RNAi研究的首选。本实验中，我们选用的是芝加哥大学医学中心 Tong-chuan He教授构建的高效筛选 siRNA的质粒表达载体 pSEB-HUS。其含有 GFP与目的基因的嵌合转录子，使 siRNA对目的基因的沉默效率直接影响 GFP蛋白的表达，siRNA对目的基因的沉默效果越明显，则 GFP蛋白的表达越弱［10］，实现了对 siRNA靶序列的高效筛选。

一系列的研究表明，GSK-3β在许多肿瘤细胞和人类肿瘤组织中高表达［14］。随着与GSK-3β相互作用分子的不断发现，GSK-3β在肿瘤形成中的重要作用受到越来越多的关注。目前有关 GSK-3β在肝癌发生发展中的作用还不明确。本研究利用Ambion公司的 siRNA靶序列分析设计系统，设计了 3对以人 GSK-3β为目标基因的 RNAi新序列（均未见文献报道），成功构建了 siRNA表达载体 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G和 pSEB-si3-G和1个阴性对照表达载体 pSEB-siN-G。将质粒转染入 HepG2细胞中，通过观察绿色荧光，pSEB-si1-G转染组绿色荧光信号明显弱于其他组，表明其对GSK-3β基因的抑制率最高，并可在 mRNA水平和蛋白水平抑制 GSK-3β的表达。siRNA与靶序列的结合与 mRNA的二级结构密切相关，靶向折叠程度较高区段设计的 siRNA序列可能很难与mRNA结合，其对目的基因的抑制效果就较差。本研究中 pSEB-si1-G对 GSK-3β的抑制效果要优于其他两个，很可能是因为它的靶序列所在区域的折叠程度不高，利于其与 GSK-3β mRNA的结合。

为了研究 GSK-3β是否对肝癌细胞的生长和生存发挥重要作用，我们利用构建好的 siRNA表达载体下调了肝癌细胞 HepG2中 GSK-3β的表达，并分别检测了细胞的增殖和凋亡情况。由于我们构建的 siRNA表达载体中含有 GFP表达元件，对Annexin V和 PI的荧光信号会造成一定的干扰，因此不适合用 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。鉴于 caspase-3在早期凋亡中的重要作用，我们通过分析细胞中 caspase-3活性的变化来反映细胞凋亡的改变。结果表明，pSEB-si1-G抑制GSK-3β的表达后，可明显抑制 HepG2细胞的增殖，并促进细胞凋亡的发生。因此我们认为，GSK-3β的表达与肝癌细胞 HepG2的生长和生存密切相关，提示 GSK-3β可以作为肝癌基因治疗的有效靶点，有关 GSK-3β调控肝癌细胞生长和生存的具体机制还有待进一步的研究。

［1］ DobleBW，WoodgettJR.GSK-3:tricksofthetradefora multi-tasking kinase.J Cell Sci，2003，116（Pt 7）:1175-1186.

［2］ Kaidanovich-Beilin O，Woodgett JR.GSK-3:functional insights from cell biology and animal models.Front Mol Neurosci，2011，4:40.

［3］ Jope RS，Johnson GV.The glamour and gloom of glycogen synthase kinase-3.Trends Biochem Sci，2004，29（2）:95-102.

［4］ Amar S，Belmaker RH，Agam G.The possible involvement of glycogen synthase kinase-3（GSK-3）in diabetes，cancer and central nervous system diseases.Curr Pharm Des，2011，17（22）:2264-2277.

［5］ Deng H，Zhang N，Wang Y，et al.S632A3，a new glutarimide antibiotic，suppresses lipopolysaccharide-induced pro-inflammatory responses via inhibiting the activation of glycogen synthase kinase 3β. Exp Cell Res，2012，318（20）:2592-2603.

［6］ Bilim V，Ougolkov A，Yuuki K，et al.Glycogen synthase kinase-3:a new therapeutic target in renal cell carcinoma.Br J Cancer，2009，101（12）:2005-2014.

［7］ Banerji V，Frumm SM，Ross KN，et al.The intersection of genetic and chemical genomic screens identifies GSK-3α as a target in human acute myeloid leukemia.J Clin Invest，2012，122（3）:935-947.

［8］ Bang D，Wilson W，Ryan M，et al.GSK-3α promotes oncogenic KRAS function in pancreatic cancer via TAK1-TAB stabilization and regulation of noncanonical NF-κB.Cancer Discov，2013，3（6）:690-703.

［9］ Kawazoe H，Bilim VN，Ugolkov AV，et al.GSK-3 inhibition in vitro and in vivo enhances antitumor effect of sorafenib in renal cell carcinoma（RCC）.Biochem Biophys Res Commun，2012，423（3）: 490-495.

［10］Luo Q，Kang Q，Song WX，et al.Selection and validation of optimal siRNA target sites for RNAi-mediated gene silencing.Gene，2007，395（1-2）:160-169.

［11］Deng H，Mao G，Zhang J，et al.IKK antagonizes activation-induced cell death of CD4+T cells in aged mice via inhibition of JNK activation.Mol Immunol，2010，48（1-3）:287-293.

［12］ElbashirSM，HarborthJ，LendeckelW，etal.Duplexesof 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature，2001，411（6836）:494-498.

［13］Huang PI，Lo WL，Cherng JY，et al.Non-viral delivery of RNA interference targeting cancer cells in cancer gene therapy.Curr Gene Ther，2012，12（4）:275-284.

［14］Chiara F，Rasola A.GSK-3 and mitochondria in cancer cells.Front Oncol，2013，3:16.

Methods The cDNA of GSK-3β was amplified by RT-PCR from the total RNA of L02 cells，and then inserted into pSEB-HUS vector to generate pSEB-G plasmid.The synthesized siRNAs targeting the coding region of human GSK-3β were cloned into pSEB-G respectively，resulting in the pSEB-si1-G，pSEB-si2-G，pSEB-si3-G and pSEB-siN-G plasmids.These plasmids were transiently transfected into HepG2 cells，and the expression levels of GSK-3β were detected by green fluorescent signal，RT-PCR，and Western blot.The effects of siRNAs on proliferation and apoptosis of HepG2 cells were determined by MTT assay and caspase-3 activity assay.

Results All plasmids were successfully constructed as confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.The pSEB-si1-G vector had the most significant knockdown effect on GSK-3β among the constructed plasmids.GSK-3β silencing resulted in marked decrease of proliferation and increase of caspase-3 activity in HepG2 cells.

Conclusion A siRNA expression vector targeting GSK-3β is successfully constructed and validated for its knockdown effect，and silencing of GSK-3β can significantly inhibit HepG2 cell proliferation and induce its apoptosis.

Vector-mediated RNAinterference of GSK-3β expression in hepatoma cell

ZHANG Na，LIU Lu，DOU Yue-ying，WANG Zhen，SONG Dan-qing，LI Dian-dong，DENG Hong-bin

Objective To construct a vector expressing siRNA targeting human GSK-3β gene and to investigate its effects on proliferation and apoptosis of HepG2 cells.

Glycogen synthase kinase 3β；RNAinterference；Carcinoma，hepatocellular；siRNAvector

DENG Hong-bin，Email:hdeng@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.007

北京协和医学院“协和青年基金”（3332013144）；国家自然科学基金面上项目（81473248、81170326）

100050北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所生化室

邓洪斌，Email：hdeng@imb.pumc.edu.cn

2014-09-02

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术，2015，10（2）:131-138

Author Affiliation:Department of Biochemistry，Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:131-138