H PLC-U V测定归脾丸（浓缩丸）中酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷的含量

赵群涛　杨俊杰　方永凯　盚罡　李丹

（1信阳市食品药品检验所，河南信阳464000；2信阳农林学院生物技术系）

H PLC-U V测定归脾丸（浓缩丸）中酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷的含量

赵群涛1杨俊杰2方永凯1盚罡1李丹1

（1信阳市食品药品检验所，河南信阳464000；2信阳农林学院生物技术系）

目的：建立高效液相色谱紫外检测法（HPLC-UV）同时测定归脾丸（浓缩丸）中酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷含量的方法。方法：色谱柱为Thermo Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水为流动相（28∶72），检测波长204 nm；流速1.0 mL/min；柱温28℃。结果：酸枣仁皂苷A进样量在2.53～15.18 μg，黄芪甲苷进样量在2.55～15.30 μg范围内呈良好线性关系，回收率分别为99.1%和98.4%。结论：该方法灵敏、重复性好，可用于归脾丸（浓缩丸）的质量控制。

归脾丸（浓缩丸）；酸枣仁皂苷A；黄芪甲苷；高效液相色谱紫外检测法

归脾丸（浓缩丸）由党参、白术、黄芪、当归、远志、酸枣仁、甘草等13味中药组成，现收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第七册》，有益气健脾、养血安神的功效，用于心脾两虚，失眠多梦，头昏头晕，崩漏便血等症。该制剂中黄芪和酸枣仁分别是补气和安神的代表性药物，其主要有效成分分别是黄芪甲苷和酸枣仁皂苷A。本研究在前期实验基础上考察高效液相色谱紫外检测法（HPLCUV）测定归脾丸（浓缩丸）中这两种成分含量的可行性。

1　仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（DAD检测器），Waters高效液相色谱仪（2489紫外检测器串联2420蒸发光检测器，高效液相色谱-紫外检测器联用蒸发光散射检测器（HPLC-UV-ELSD））；METTLER TOLEDO XS205电子天平，基因型1850摩尔超纯水机（重庆摩尔水处理设备有限公司）。酸枣仁皂苷A（110734-200407）和黄芪甲苷（110781-201314）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈购自TEDIA Company.INC公司，均为色谱纯，水为Ⅰ级超纯水，其他试剂均为分析纯。归脾丸（浓缩丸）均为市售，见表1。

表1　样品含量测定结果 （mg/g）

2　方法与结果

2.1色谱条件

Agilent 1260色谱仪，Thermo Hypersil BDS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-水（28∶72）作流动相，检测波长204 nm，流速1.0 mL/min；柱温28℃；进样量10 μL。

2.2试液的制备

2.2.1混合对照品溶液精密称取两种对照品适量，加甲醇制成含酸枣仁皂苷A 0.506 mg/mL、黄芪甲苷0.51 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液将本品研碎，取约8.0 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇适量回流提取6 h，提取液水浴蒸干，残渣用水25 mL微热使溶解，转移至分液漏斗中，用石油醚（60～90℃）洗涤3次，每次25 mL，水液用水饱和的正丁醇提取3次，每次25 mL，再用正丁醇饱和的0.5%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次25 mL，蒸干正丁醇提取液，残渣加甲醇转移至5 mL量瓶中，用0.45 μm滤膜过滤测定。

2.2.3阴性样品溶液根据归脾丸（浓缩丸）的处方，制备不含黄芪和酸枣仁的阴性样品，按上述方法制成阴性样品溶液。

2.3专属性试验

分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按“2.1”色谱条件测定，结果阴性无干扰，见图1。

图1　HPLC-UV色谱图

2.4检测限和定量限

将各对照品色谱峰测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，分别以信噪比为3∶1及10∶1时注入仪器的量确定检测限和定量限，结果见表1。

2.5线性关系考察

精密吸取混合对照品储备溶液5，10，15，20，30 μL，按“2.1”色谱条件进行测定，分析结果以峰面积Y对对照品的进样量X（μg）进行回归，得回归方程、相关系数及线性范围，结果见表2。

2.6精密度试验

精密吸取样品溶液连续进样6次，计算峰面积积分值，酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷的RSD分别为0.8%和1.0%，表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于0，1，3，6，9，12，24 h测定，记录峰面积，酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷的RSD分别为1.1%和1.3%，结果显示样品溶液在24 h内稳定。

2.8重复性试验

取同一批（140309）样品按“2.2”项方法平行制备6份，按“2.1”色谱条件测定酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷的含量，计算RSD。测得酸枣仁皂苷A的含量分别为0.293，0.290，0.299，0.296，0.297，0.291 mg/g，RSD为1.2%；黄芪甲苷的含量分别为0.210，0.213，0.217，0.216，0.219，0.215 mg/g，RSD为1.5%，结果表明本方法重复性良好。

2.9加样回收率试验

精密称取两种对照品适量制成含酸枣仁皂苷A 1.15 mg/mL、黄芪甲苷0.85 mg/mL的混合对照品溶液。取同一批（140309）样品6份，每份约8.0 g，精密称定，精密加入上述混合对照品溶液2 mL，按“2.2.2”项方法制备，再按“2.1”色谱条件测定酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷的含量并计算回收率。结果见表3。

2.10样品测定

按照“2.2.2”方法制备5个批号样品，按“2.1”色谱法测定酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷的含量，结果见表1。

3　讨论

表2　对照品线性关系考察

表3　加样回收率测定结果（n=6）

3.1用DAD检测器在190～400 nm扫描对照品溶液，发现酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷均仅有末端吸收。在Waters色谱仪上用HPLC-UV-ELSD法测定5个厂家的样品，当不用石油醚洗涤甲醇提取液［1］时，紫外检测器检测的样品峰太多，两种待检测成分峰响应比较低，且不容易与前后峰分开，批分析100 min时上一针未出完峰仍会淹没下一针样品的这两种成分峰，导致下针无待分析成分峰，在Agilent 1260色谱仪DAD检测器上也是这种情况，说明不能用HPLC-UV法分析；而在蒸发光检测器下样品峰较少，两种待测成分峰较高并与邻近峰分离良好，可以满足分析要求。样品用石油醚洗涤除杂，在两台仪器上经方法学考察，HPLC-UV法可以满足测定要求。

3.2样品处理比较了甲醇常温超声30 min、回流4 h和索氏提取6 h［2-3］，结果超声和回流不同时间提取液的酸枣仁皂苷A和黄芪甲苷含量相差不大，均低于索氏提取的含量。经试验石油醚索氏提取5 h脱脂［4］后再用甲醇索氏提取或甲醇索氏提取后用石油醚萃取［5］，两种提取方法测得的两种待测成分的含量没有明显差别，但甲醇提取液蒸干后油脂较大，后者更利于下一步正丁醇的提取且萃取较索氏提取用时更少。测试结果表明用正丁醇饱和的0.5%氢氧化钠溶液洗涤正丁醇提取液，比用氨试液［6］和1%氢氧化钠溶液洗涤［3］的两种待测成分的含量高。甲醇索氏提取液蒸干后用水转移直接过D101大孔树脂柱处理［1，3］，样品溶液因油脂太大极难过滤；用本文方法处理5个厂家的样品溶液再经D101大孔树脂柱处理［3］，有的样品待测成分会比本文的方法略高，但不显著，有的含量反而没有本文的方法高，说明增加提取步骤会加大误差，经考察本文的方法已能满足分析要求，不同提取方法测定结果见表4。

表4　不同提取方法样品含量测定结果（mg/g）

3.3归脾丸（浓缩丸）原标准没有含量测定项，目前测定黄芪和酸枣仁药材及其制剂中黄芪甲苷和酸枣仁皂苷A含量的文献多是用HPLC-ELSD［1-4，6］，还未见用HPLC-UV同时测定这两种成分的文献报道，经考察用HPLC-UV也能满足实验分析要求且HPLC-UV应用更广泛。实验过程中曾考虑同时测定补气药黄芪中黄芪甲苷、补血药当归中阿魏酸、安神药酸枣仁皂苷A和调和药甘草中甘草酸含量，通过测定君臣佐使药以全面控制归脾丸（浓缩丸）质量，为分析不同厂家的产品提供依据［7］，但研究表明黄芪甲苷和酸枣仁皂苷A的正丁醇提取液不用氨试液等碱液洗涤，样品干扰成分增多影响分离且导致待测成分含量降低，用碱液会破坏酸性成分阿魏酸和甘草酸，这4种成分不能用一种方法进行提取，同时由于HPLC-UV样品峰较多，即使分别提取也不能用同一分析方法测定，最终无法实现4种成分的同时测定。

［1］王景.HPLC测定归脾丸（浓缩丸）中黄芪甲苷的含量［J］.中国当代医药，2010，17（26）：46-47.

［2］朱颖虹，葛小明.HPLC-ELDS法测定玉屏风颗粒中黄芪甲苷的含量［J］.现代食品与药学杂志，2007，17（6）：40-44.

［3］邢婕，秦雪梅，张丽增.HPLC-ELDS法测定黄芪甲苷含量供试品溶液制备方法改进［J］.山西大学学报（自然科学版），2008，31（4）：577-579.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：344.

［5］李玉娟，车镇涛，毕开顺，等.反相高效液相法测定酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量［J］.中国中药杂志，2001，26（5）：309-310.

［6］陈骁勇，葛玉松.HPLC-ELDS法测定参芪五味子片中黄芪甲苷和酸枣仁皂苷A的含量［J］.中国药师，2012，15（12）：1743-1745.

［7］赵群涛，方永凯，杨俊杰，等.不同厂家归脾丸（浓缩丸）中阿魏酸和甘草酸含量考察［J］.中国执业药师，2015，12（4）：16-19.

Simultaneous Determination of Jujubosede A and AstragalosideⅣin Guipi Pills（Concentrated Pills）by HPLC-UV

Zhao Quntao1，Yang Junjie2，Fang Yongkai1，Qiu Gang1，Li Dan1
（1 Xinyang Institute for Food and Drug Control，Henan Xinyang 464000，China；2 Biotechnology Department of Xinyang Agriculture and Forestry College）

Objective:To establish a method for the simultaneous determination of the contents of jujuboside A and astragalosideⅣin guipi pills（concentrated pills）by HPLC-UV.Methods:HPLC-UV was performed on Thermo Hypersil BDS C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with a mobile phase of acetonitrile-water（28∶72），detection wavelength was at 204 nm，the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was at 28℃. Results:A good linear relationship was obtained within the range of 2.53～15.18 μg and 2.55～15.30 μg for jujuboside A and astragalosideⅣ，and the recovery rate was 99.1%and 98.4%respectively.Conclusion:The method was sensitive and reproducible and is suitable for the quality control of guipi pills（concentrated pills）.

Guipi Pills（Concentrated Pills）；Jujuboside A；AstragalosideⅣ；HPLC-UV

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.09.008

2015-05-12）

河南省2013年科技发展计划基金资助（132102310265）

赵群涛，男，主管中药师。研究方向：中药质量分析。E-mail：28843515@qq.com