黄连上清片中黄芩苷与欧前胡素的含量测定方法研究

张小博　曹恒涛　王小艳

（安阳市食品药品检验所，河南安阳455000）

黄连上清片中黄芩苷与欧前胡素的含量测定方法研究

张小博曹恒涛王小艳

（安阳市食品药品检验所，河南安阳455000）

目的：建立黄连上清片中黄芩苷和欧前胡素的高效液相色谱含量测定方法。方法：采用高效液相色谱仪，Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长：300 nm；柱温25℃，PDA检测。结果：黄芩苷在0.083～3.325 μg范围内呈良好线性关系，r=0.999 9，回收率为103.54%，RSD=1.24%；欧前胡素在0.004～0.160 μg范围内呈良好线性关系，r=0.999 9，回收率为102.69%，RSD=0.95%。结论：本方法操作简便，结果准确、可靠，可用于同一波长处同时测定黄芩苷与欧前胡素的含量。

高效液相色谱；黄连上清片；黄芩苷；欧前胡素

黄连上清片是由黄连、栀子、连翘、白芷、防风、大黄、黄芩、黄柏、菊花等17味药材组成，收载于《中国药典》2010年版一部［1］，具有疏风清热，泻火止痛的功效，用于头晕目眩、暴发火眼、牙齿疼痛、口舌生疮、咽喉肿痛、耳痛耳鸣、大便秘结、小便短赤。其疗效可靠，应用面广，但据文献研究，不同厂家生产的黄连上清片所含色谱峰的数目和峰面积存在很大差异［2］，说明其质量受提取工艺和药材原料的影响较大，而《中国药典》中仅对黄连、黄柏中的盐酸小檗碱进行了含量测定，对大黄和栀子进行了薄层鉴别。近年来，相继有文献［3-4］报道，采用高效液相色谱法（HPLC）对黄连上清片中大黄素、大黄酚及连翘苷等有效成分进行含量测定的研究，本研究则对《中国药典》中未进行检查的黄芩苷及白芷药材中香豆素类代表成分欧前胡素的含量测定方法进行了研究，通过对7批不同生产厂家的黄连上清片中黄芩苷及欧前胡素的含量测定，比较其质量，为进一步提高黄连上清片的质量标准提供参考依据。

1　仪器与材料

1.1实验仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），XS205DU型电子天平（METTLER-TOLEDO）。

1.2试剂与样品

黄芩苷（批号：110715-201117），欧前胡素（批号：110827-201109），乙腈（色谱纯，J.T.BAKER）。超纯水为Molecular纯水机制备。黄连上清片（7批均采购于药品经营企业）。

2　方法与结果

2.1色谱分析条件

黄芩苷及欧前胡素检测条件：色谱柱为Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水，流动相梯度见表1；检测器：waters 2998 PDA检测器；检测波长：300 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃。

2.2对照品及供试品溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备精密称取黄芩苷和欧前胡素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含黄芩苷83 μg，欧前胡素4 μg的混合溶液。

2.2.2供试品溶液的制备取黄连上清片10片，除去包衣，研细，精密称取2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

表1　流动相梯度

2.3阴性样品溶液的制备

按处方制备工艺制得不含黄芩、白芷的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

2.4阴性试验

取阴性对照样品溶液、对照品溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性样品溶液在黄芩苷峰及欧前胡素峰位置处无相应峰出现，阴性对照样品、对照品和供试品溶液色谱图见图1。

2.5线性范围考察

分别精密吸取上述对照品溶液1，2，5，10，20，30，40 μL，按“2.1”色谱条件测定峰面积，以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明，黄芩苷在0.083～3.325 μg范围内呈良好线性关系，回归方程为：

Y=2 096 961.24 X-37 696.54（r=0.999 9）。

欧前胡素在0.004～0.160 μg范围内呈良好线性关系，回归方程为：

Y=2 836 551.80 X-1 759.03（r=0.999 9）。

图1　HPLC色谱图

2.6精密度试验考察

取对照品溶液，分别精密吸取10 μL，连续进样6次，按上述色谱条件进样分析，测定色谱峰面积，黄芩苷的RSD为1.43%，欧前胡素的RSD为1.32%，测定结果表明精密度良好。

2.7稳定性试验考察

取供试品溶液，分别在0，2，5，12，24 h，分别进样分析，测定色谱峰面积，求得黄芩苷的RSD为1.51%，欧前胡素的RSD为1.15%。试验结果表明供试品溶液在制备24小时内，待测组分化学性质稳定。

2.8重复性试验考察

取同一样品按“2.2.2”方法制备供试品溶液6份，按上述色谱条件分别测定黄芩苷和欧前胡素的含量，测得黄芩苷的RSD为1.23%，欧前胡素的RSD为0.61%，表明重复性较好。

2.9加样回收率试验考察

取样品6份，每份30片，除去包衣，研细，精密称取0.45 g，分别精密加入对照品混合溶液（重新配制）1.0 mL（黄芩苷浓度为0.415 6 mg/mL，欧前胡素浓度为0.026 7 mg/mL），精密加入甲醇10 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，滤过，进样，计算加样回收率。结果见表2。

2.10样品含量测定

取7批不同厂家的黄连上清片，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定样品含量（mg/g），结果见表3。

3　讨论

表2　加样回收率测定结果

表3　样品含量测定结果

3.1在对黄连上清片中的黄芩及白芷进行高效液相色谱分析时，分别考察了甲醇、50%甲醇［5］、70%乙醇3种溶剂的提取效率及乙腈-0.05%磷酸水溶液［6］及乙腈-水两种流动相体系，结果表明，以甲醇为提取溶剂，超声处理30 min，可将黄连上清片中待测成分基本提取完全；以乙腈-水为流动相体系梯度洗脱得到的色谱图基线平稳分离效果好，检测波长在300 nm处时色谱峰响应灵敏度高，因此可在同一波长处同时测定黄芩苷及欧前胡素的含量。药典中要求进行含量测定的盐酸小檗碱为生物碱类有效成分，本方法采用乙腈-水为流动相体系，无法同时检出。

3.2通过对比可知，不同生产厂家的黄连上清片中黄芩苷及欧前胡素的含量波动较大。样7中黄芩苷的含量为样3的3.5倍，样1中欧前胡素的含量与样5相差十几倍，而样6中未检出欧前胡素，由此可见，不同厂家的生产工艺、药材投料量及药材质量存在较大差异，而药典中仅以盐酸小檗碱的含量作为检验标准，不利于黄连上清片的质量控制。

3.3本方法操作简便、快捷，样品用量少，回收率和线性相关系数良好，精密度和重复性好，可作为黄连上清片中黄芩苷和欧前胡素含量的质量控制方法。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：1067-1068.

［2］唐显虹.不同厂家黄连上清片特征指纹图谱比较［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（24）：67-71.

［3］李静，蔡旭升.高效液相色谱法在黄连上清片中有效成分的含量测定［J］.中国中医药资讯，2011，3（17）：55-56.

［4］张峰，梁艳.高效液相色谱法测定黄连上清片中连翘苷含量［J］.中国药业，2011，20（22）：44-45.

［5］刘永路，容淑盈.高效液相色谱法测定黄连上清片中黄芩苷含量［J］.中国药业，2007，16（12）：43-44.

［6］戴红锋，尹庆锋，谢彤.UPLC法测定复方虎黄喷剂中虎杖苷、黄芩苷、欧前胡素［J］.南京中医药大学学报，2014，30（1）：88-89.

［7］王连国，王欣，孟宪杰，等.高效液相色谱法测定白芷中欧前胡素和异欧前胡素含量［J］.现代中西医结合杂志，2011，20（22）：2816-2817.

Study on Content Determination of Baicalin and Imperatorin in Huanglianshangqing Tablets

Zhang Xiaobo，Cao Hengtao，Wang Xiaoyan（Institute for Food and Drug Control of Anyang City，Henan Anyang 455000，China）

Objective:To establish a method for the determination of baicalin and imperatorin in huanglianshangqing tablets by HPLC.Methods：Using high performance liquid chromatography（HPLC）and a Waters Symmetry C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitrile-water in gradient elution，the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was at 300 nm，the column temperature was at 25℃and detected by PDA.Results：A good linear relationship of baicalin was obtained within the range of 0.083～3.325 μg（r=0.999 9）and the average recovery was 103.54%（RSD=1.24%），and a good linear relationship of imperatorin was found within the range of 0.004～0.160 μg（r=0.999 9）and the average recovery was 102.69%（RSD= 0.95%）.Conclusion:The method was convenient，accurate and reliable，and can be used for the simultaneous determination at the same wavelength of the contents of baicalin and imperatorin in huanglianshangqing tablets.

HPLC；Huanglianshangqing Tablets；Baicalin；Imperatorin

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.09.007

2015-04-20）

张小博，女，主管药师。研究方向：药品质量。通讯作者E-mail：ayzhbo@163.com