声门上型喉癌中环氧化酶-2的表达及与微血管和淋巴管密度的关系

王智勇，成伟，梁中敏，刘维奇，潘祖远，梁滔

声门上型喉癌中环氧化酶-2的表达及与微血管和淋巴管密度的关系

王智勇，成伟，梁中敏，刘维奇，潘祖远，梁滔

目的探讨环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在声门上型喉癌的表达与微血管密度（microvessel density，MVD）、淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）的关系及其临床意义。方法通过免疫组化SP法对64例声门上型喉癌标本中COX-2进行检测，同时标记CD34和D2-40用以分别检测喉癌组织中MVD和LVD。结果该组喉癌中COX-2表达阳性率为70.31%，MVD为36.79±8.48，LVD为9.79±6.35。COX-2的表达与患者性别、年龄、肿瘤组织学分级无关（P＞0.05），而与肿瘤临床分期和淋巴结转移相关（P＜0.05），COX-2表达阳性组MVD及LVD高于COX-2表达阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论COX-2可能参与喉癌发生并促进血管及淋巴管生成，影响肿瘤的转移、进展和预后。

喉癌;声门上型;环氧化酶-2;微血管密度;淋巴管密度

实体肿瘤的生长、转移与肿瘤血管和淋巴管生成有关。近来研究发现，环氧化酶-2（cyclooxygen-ase-2，COX-2）不仅促进肿瘤血管生成，还可诱导淋巴管生成［1-2］。有关声门上型喉癌中COX-2表达与肿瘤血管及淋巴管生成的相互关系报道鲜见。我们应用免疫组化方法检测COX-2蛋白和CD34及D2-40的表达，并分析上述指标的相关性及临床意义。

1　资料和方法

1.1一般资料收集吉林大学第一医院和南方医科大学附属南海医院病理科2002年1月至2012年12月所存声门上型喉癌标本64例。所有标本经10%中性甲醛溶液固定，24 h石蜡包埋，常规病理HE染色诊断，均为鳞状细胞癌。其中男50例，女14例，年龄42～80岁，平均56.3岁。高分化20例，中分化28例，低分化16例。临床分期按照NCCN1997年标准，Ⅰ期14例（T1N0M0 11例，T1N1M0 2例，T1N2M0 1例），Ⅱ期23例（T2N0M0 12例，T2N1M0 10例，T2N2M0 1例），Ⅲ期18例（T3N0M0 6例，T3N1M0 9例，T3N2M0 2例，T3N3M0 1例），Ⅳ期9例（T4N0M0 2例，T4N1M0 5例，T4N3M0 2例）。颈淋巴结转移33例，无淋巴结转移31例，均为术后病理证实。另随机选择同期8例癌旁非肿瘤喉组织作为对照。两组资料在年龄、性别方面无差异（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶（streptavidin peroxidase，SP）法免疫组化技术，一抗为鼠抗CD34单克隆抗体，D2-40单克隆抗体即用型，鼠抗人COX-2多克隆抗体。操作步骤按说明书。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3结果判定COX-2阳性产物定位于细胞质内，呈棕黄色颗粒，采用染色指数计数法，染色指数=阳性细胞数×染色强度。阳性细胞百分比（0～10%、10%～30%、30%～70%、＞70%）分别记为0、1、2、3分;染色强度阴性记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分;上述两项乘积即为该例病变的COX-2的染色指数评分。依据染色指数评分分为:阴性（-）0～1分;弱阳性（+）2～3分;中度阳性（++）4～6分;强阳性（+++）5～6分。将弱阳性、中度阳性及强阳性表达合称为阳性表达。

CD34抗体显示肿瘤微血管密度（micro vessel density，MVD）。在不知临床及病理特征的情况下，在低倍镜下筛选出最高微血管密度区（肿瘤基质边缘或肿瘤间质），在放大200倍的视野下记录5个视野的微血管数，求其平均数作为该肿瘤的平均微血管数［3］。每个与邻近微血管明显分离的阳性染色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管。只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数。而直径大于8个红细胞的血管，有厚的平滑肌的血管及硬化区的血管不在计数范围内。

D2-40抗体显示肿瘤淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）。LVD的定量方法参照微血管的计数方法进行。

1.4统计学方法应用统计软件SPSS19对数据行χ2检验和t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1COX-2、CD34和D2-40在喉癌中的表达及COX-2在癌旁非肿瘤喉组织中的表达COX-2蛋白主要表达于细胞质内，呈棕黄色颗粒（图1），在喉癌组织中强、中、弱阳性表达的例数分别21、14、10例，阳性表达率为70.3%（45/64），在癌旁非肿瘤喉组织中，仅有1例呈弱阳性表达，表达率为12.5%（1/8），两组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。CD34表达阳性为棕褐色管腔样结构（图2），阳性表达率为100%，平均MVD为36.79±8.48。D2-40表达阳性为棕黄色管腔样结构（图3），阳性表达率为87.5%，平均LVD为9.68±6.35。

2.2喉癌组织中COX-2表达与临床病理特征的关系COX-2的表达与患者性别、年龄、肿瘤组织学分级无关（P＞0.05），与肿瘤临床分期和淋巴结转移相关（P＜0.05），详见表1。

表1　喉癌组织中COX-2表达与临床病理特征的关系（n=64）

2.3喉癌中COX-2表达与MVD及LVD的关系

COX-2表达阳性组中MVD及LVD均明显高于COX-2表达阴性组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2　喉癌组织中COX-2表达与MVD和LVD的关系（n=64）

3　讨论

COX-2是前列腺素合成过程中的一个重要限速酶，能将花生四烯酸转化为前列腺素G2和H2，前列腺素作为重要的炎症介质，具有促进细胞增生、抑制细胞凋亡以及刺激新生血管生成等多种功能。近年来国内外研究已发现，COX-2在舌癌、直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌及甲状腺癌等人类多种肿瘤中有较高表达，并认为其参与了肿瘤的发生发展，与肿瘤淋巴结转移和预后密切相关［4-5］。Edwards等［6］在前列腺癌和前列腺增生病例研究中发现，前列腺癌中COX-2的表达明显高于前列腺增生组织中的表达;Da等［7］报道胃癌组织中COX-2的过度表达与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移有关;目前认为COX-2参与肿瘤的可能机制:COX-2促癌与其诱导细胞增殖、抑制凋亡、增强肿瘤的侵袭性及转移活性、抑制免疫等多方面的活性有关。本研究通过对64例声门上型喉癌的研究发现，COX-2在喉癌中的阳性表达率为70.3%，而在8例癌旁的非肿瘤喉组织中仅见1例呈弱阳性表达，表达率为12.5%，差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究中COX-2的表达与临床分期和淋巴结转移相关（P＜0.05），而与患者肿瘤组织学分级无关（P＞0.05），该结果与蒋代华等［8］在鼻咽癌中的研究结果一致。提示COX-2的可能与声门上型喉癌的发生、发展及侵袭转移有关，而并不参与喉癌肿瘤组织的分化，与肿瘤恶性程度无关。

血管生成对肿瘤细胞生长和侵袭起到重要作用，肿瘤中微血管的增多增加了肿瘤的血供，大量的肿瘤血管形成也增加了肿瘤细胞进入循环，产生远处转移的机会;新形成的微血管在形态和结构上也存在明显的缺陷，其基底膜较为薄弱且存在较大的裂隙，使肿瘤细胞易侵入有缺陷的微血管而产生转移。本研究发现COX-2阳性表达组MVD明显高于COX-2阴性表达组，这一结果与Mao、Zhao等［1，9］报道相同，提示喉癌组织中COX-2可能是促进新生血管形成的重要因素，参与肿瘤的发生、发展、转移等。

颈淋巴结转移是喉癌主要的转移途径。目前认为COX-2不仅有促进肿瘤血管生成的作用，还可诱导肿瘤的淋巴管形成。Su等［10］在对非小细胞肺癌的研究中发现:COX-2可以通过其代谢产物前列腺素E2（PGE2）上调VEGF-C的表达，从而促进淋巴管生成。有关声门上型喉癌COX-2表达与淋巴管密度的关系报道较少。本研究结果显示COX-2阳性表达组LVD值明显高于COX-2阴性表达组，这一结果又与Soumaoro等［11］在结肠癌中研究结果一致，提示COX-2可能与人声门上型喉癌的淋巴管形成有关。

综上所述，声门上型喉癌组织中COX-2的表达与肿瘤临床分期和淋巴结转移有关，COX-2可能促进喉癌新生血管的形成及淋巴管的生成，对肿瘤的发生、发展起着重要作用。声门上型喉癌中环氧化酶-2的表达及与微血管和淋巴管密度的关系有助于进一步了解声门上型喉癌的生物学行为，对判断预后和指导治疗，具有重要的临床意义。

［1］Mao XY，Wang XG，Lv XJ，et al.COX-2 expression in gastric cancer and its relationship with angiogenesis using tissue microarray［J］.World J Gastroenterol，2007，13（25）:3466-3471.

［2］Zhang XH，Huang DP，Guo GL，et al.Coexpression of VEGF-C and COX-2 and its association with lymphangiogenesis in human breast cancer［J］.BMC Cancer，2008，8（6）:4-10.

［3］成伟，李晓明，全成实，等.喉癌微血管生成中P53 nm蛋白和血管内皮生长因子的作用［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，2000，35（2）:147-149.

［4］曾曙光，周磊，陈伟良，等.舌鳞癌与其颈淋巴结转移癌组织中iNOS与COX-2的表达差异［J］.中山大学学报:医学科学版，2006，27（2）:157-160.

［5］胡贤杰，郭贵龙，顾馨，等.环氧化酶-2在甲状腺乳头状癌中的表达及对淋巴管生成的影响［J］.实用肿瘤杂志，2008，23（4）:338-341.

［6］Edwards J，Mukherjee R，Munro AF，et al.HER2 and COX2 expression in human prostate cancer［J］.Eur J Cancer，2004，40（1）:50-55.

［7］Da MX，Wu XT，Wang J，et al.Expression of cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth factor-C correlates with lymphangiogenesis and lymphatic invasion in human gastric cancer［J］.Arch Med Res，2008，39（1）:92-99.

［8］蒋代华，郭德玉，刘友生，等.环氧化酶-2在鼻咽癌中的表达及其临床意义［J］.局解手术杂志，2004，13（3）:152-154.

［9］Zhao QT，Yue SQ，Cui Z，et al.Potential involvement of the cyclooxygenase-2 pathway in hepatocellular carcinoma-associated angiogenesis［J］.Life Sci，2007，80（5）:484-492.

［10］Su JL，Shih JY，Yen ML，et al.Cyclooxygenase-2 induces EP1-and HER-2 Neu-dependent vascular endothelial growth factor-C up-regulation:a novel mechanism of lymphangiogenesis in lung adenocarcinoma［J］.Cancer Res，2004，64（2）:554-564.

［11］Soumaoro LT，Uetake H，Takagi Y，et al.Coexpression of VEGF-C and Cox-2 in human colorectal cancer and its association with lymph node metastasis［J］.Dis Colon Rectum，2006，49（3）:392-398.

The expression of COX-2 and its relationship with microvessel density and lymphatic vessel density in supraglottic laryngeal carcinoma

WANG Zhiyong，CHENG Wei，LIANG Zhongmin，LIU Weiqi，PAN Zuyuan，LIANG Tao.

（Department of Otolaryngology，Nanhai Hospital of Southern Medical Uniuersity，Foshan 528200，China）

CHENG Wei，E-mail:nhyycw518@126.com

ObjectiveTo study the expression of cyclooxygenase-2（COX-2）and its correlation with microvessel density（MVD）and lymph vessel density（LVD）in supraglottic laryngeal carcinoma，as well as to analyze the clinicopathological significance.MethodsThe expression COX-2 were detected by SP immunohistochemical staining in 64 case patients of supraglottic laryngeal carcinoma，CD34 and D2-40 marking were used to measure the MVD and LVD.ResultsThe positive rate of COX-2 was 70.31%，MVD was 36.79±8.48，LVD was 9.79± 6.35.The expression of COX-2 were closely associated with clinical stage and lymphatic metastasis（P＜0.05），but not related with age，sex and histological grade of the tumor（P＞0.05）.The MVD and LVD of cases with positive COX-2 expression was significantly higher than those without COX-2 expression（P＜0.05）.Conclusion

laryngeal carcinoma;supraglottic;cyclooxygenase-2;microvessel density;lymph vessel density

佛山市科技攻关项目立项课题（No.201108148）

作者单位:528200广东佛山，南方医科大学附属南海医院耳鼻咽喉科

王智勇，男，主治医师，主要从事耳鼻咽喉科的临床诊治工作，E-mail:wzy2004269@sina.com

成伟，男，主任医师，主要从事头颈外科临床及科研工作，E-mail:nhyycw518@26.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.01.007

1674-4136（2015）01-0027-03

2014-06-25］［本文编辑:李庆］

COX-2 may contribute to tumorigenesis and may have a function on promoting angiogenesis and lymphangiogenesis in supraglottic laryngeal carcinoma，hence affect tumor metastases，progression and prognosis.