大肠杆菌产海藻糖合成酶发酵条件优化

杨梅玉，赵　伟，陈文娜，张曰辉，曹大鹏

（山东福洋生物科技有限公司，山东德州253100）

大肠杆菌产海藻糖合成酶发酵条件优化

杨梅玉，赵伟，陈文娜，张曰辉，曹大鹏

（山东福洋生物科技有限公司，山东德州253100）

采用单因素试验和正交试验，研究海藻糖合成酶发酵过程中加诱导剂时菌浓OD600nm、诱导温度、诱导时间、海藻糖合成酶转化海藻糖时间4个因素对转化率的影响，确定大肠杆菌产海藻糖合成酶转化海藻糖的最优条件组合。结果表明，转化时间和诱导温度对转化率的影响较大，在大肠杆菌生长到菌浓OD600nm值为0.8时加诱导剂，诱导温度26℃保持8 h，在转化过程中反应14 h为最佳搭配。在此最佳条件下，海藻糖的转化率可达69.29%。

海藻糖；海藻糖合成酶；大肠杆菌；发酵条件

海藻糖（trehalose）又称α-D-吡喃葡糖苷基-α-D-吡喃葡糖苷，是一种非还原性二糖，无毒无害，在自然界中许多可食用的动植物及微生物体内广泛存在，被称为“生命之糖”［1-2］。海藻糖具有良好的稳定性和独特的生物学特性，如对生物体和生物大分子具有优良的抗逆保护作用。大量研究表明，生物体对外界环境胁迫（如干燥、高温、高渗透压、辐射等）表现出的抗逆耐受力与其体内存在的海藻糖有直接关系［3-6］。海藻糖的生产方法主要有天然生物提取法、微生物发酵法、化学合成法、基因工程法和酶转化法［1］。其中酶转化法生产海藻糖一直是工业生产海藻糖的主要途径。海藻糖合成酶（trehalose synthase）是生产海藻糖的工业酶，其通过转糖基作用直接将麦芽糖的α-1，4糖苷键转化为α-1，1糖苷键生成海藻糖，反应流程短，非常容易调节和控制，既不需要消耗高能物质，也不需要与磷酸盐共存，海藻糖的转化率高且不受麦芽糖浓度的影响，麦芽糖价格低廉易得，因此在工业化生产海藻糖中具有良好的应用前景［7-10］。

海藻糖合成酶主要存在于微生物细胞中［11］，大部分已发现的野生菌株存在细胞海藻糖合成酶酶活较低，海藻糖产率低等问题，目前工业应用的菌种一般均为基因工程菌。黄英等［12］在大肠杆菌（Escherichia coli）中采用克隆技术表达了玫瑰链霉菌（Streptosporangium roseum）海藻糖合成酶基因，所产的海藻糖合成酶可转化82%以上的麦芽糖形成海藻糖。高超等［13］将哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii）中克隆获得的海藻糖双功能合成酶基因（tpsp）表达到E.coli中，通过发酵罐转化，海藻糖的产量达到13.3 g/L。宿玲恰等［14］通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增获得来源于嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）ATCC33923的海藻糖合酶基因Tre S，构建了基因工程菌E.coli，通过摇瓶工艺优化，转化率最高49.0%。

本研究通过单因素试验和正交试验，检测海藻糖合成酶发酵过程中加诱导剂时的菌浓OD600nm、诱导温度、诱导时间、海藻糖合成酶转化海藻糖过程中转化时间4个因素，寻找大肠杆菌产海藻糖合酶转化海藻糖的最优条件组合，为海藻糖工业化生产提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

大肠杆菌（Escherichia coli）：山东福洋生物科技有限公司。

1.1.2培养基

种子培养基：NaCl 10 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氨苄西林钠0.1 g/L。

发酵培养基：葡萄糖4.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、KH2PO43.0 g/L、Na2HPO4·12H2O 15.1 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、无水CaCl20.01 g/L、玉米浆1 mL/L、氨苄西林钠0.1 g/L，25%氨水和5%的磷酸，控制pH 7.0。

1.1.3试剂

酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、七水硫酸镁、氯化铵、无水氯化钙（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；海藻糖：美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）：西陇化工股份有限公司；氨水：莱阳市康德化工股份有限公司；注射用氨苄西林钠：山东鲁抗医药股份有限公司。

1.2仪器与设备

15 L发酵罐和过程参数检测与控制系统FUS-15L（A）：国家生化工程技术研究中心（上海）；尾气过程质谱仪MAX300-LG：美国Extrel公司；InPro3250 pH电极和Inpro 6800溶氧电极：美国METTIER TOLEDO公司；LC-20AT型高效液相色谱仪（配Waters 515泵、Waters 2414型示差折光检测器、N2000双通道色谱工作站）：美国Waters公司；722型分光光度计：上海奥谱勒仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1海藻糖合成酶的诱导

将低温保存的大肠杆菌菌株QB1接种到种子培养基中活化，在摇床上转速220 r/min，温度37℃条件下培养6～8 h。无菌条件下转接到15 L发酵罐中，接种量1%，在温度37℃、转速600 r/min、通气量7.5 L/min、pH 7.0的条件下发酵大肠杆菌。当菌种达到适当菌浓时降低温度，流加终含量为0.2%的乳糖诱导。

1.3.2海藻糖合成酶粗酶液的制取

诱导后的大肠杆菌发酵液在10 000 r/min条件下离心10 min收集菌体，用50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）洗涤菌体，并定容至原发酵液体积，配成菌悬液，匀浆机破碎3次，即得到海藻糖合成酶粗酶液。

1.3.3海藻糖合成酶转化海藻糖

以终含量为30%的麦芽糖水溶液作为底物进行转化，具体为150 mL三角瓶中加入20 mL 75%的麦芽糖和30 mL粗酶液，混匀，于55℃、120 r/min摇床中反应。结束后取出，沸水浴10min灭酶，冷却过滤后用超纯水稀释100倍，0.22μm微孔滤膜过滤后进行海藻糖含量的测定。

1.3.4海藻糖转化率的测定

采用高效液相色谱法分析转化液中海藻糖的含量［15］。色谱条件：流动相为乙腈/水=4∶1，混匀后加0.1%的氨水作为保护剂。色谱柱为XBridgeTMNH2（3.5 μm×4.6 μm× 250 mm），柱温35℃，检测器为示差折光显示器，检测器温度40℃，流速1 mL/min，进样量20 μL。

海藻糖标准曲线的制作：用超纯水分别配制海藻糖质量浓度分别为0、0.6 g/L、1.2 g/L、1.8 g/L、2.4 g/L和3 g/L的标准溶液，高效液相分析后以海藻糖质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程，y=247 967x+11 266，相关系数R2=0.999 2。根据回归方程计算样品中海藻糖的含量。

1.3.5发酵条件优化

（1）单因素试验

检测4个因素对海藻糖转化率的影响：海藻糖合成酶发酵过程中加诱导剂时的菌浓OD600nm、诱导温度、诱导时间、海藻糖合成酶转化海藻糖过程中转化时间。

（2）发酵条件优化正交试验

根据单因素试验结果进行正交试验分析，以海藻糖转化率为评价指标，确定正交试验4因素的水平范围。正交试验因素与水平见表1。

表1　发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1菌体浓度对转化率的影响

将活化后的大肠杆菌按接种量1%接种到15 L发酵罐中，在温度37℃、转速600 r/min、通气量7.5 L/min、pH 7.0的条件下发酵大肠杆菌。当不同罐中大肠杆菌菌浓OD600nm分别达到0.4、0.6、0.8、1.0、1.2时，温度均降为26℃，添加终含量为0.2%的乳糖诱导8h。下罐发酵液在10000r/min条件下离心10min收集菌体，用50mmol/L磷酸缓冲溶液（pH7.0）洗涤菌体，并定容至原发酵液体积，配成菌悬液，匀浆机破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30 mL粗酶液和20 mL 75%的麦芽糖加入150 mL锥形瓶中55℃、120 r/min摇床中反应12 h，沸水浴10 min灭酶后测定海藻糖的转化率，结果见图1。

图1　菌体浓度对转化率的影响Fig.1 Effect of bacteria concentration on conversion rate

由图1可知，海藻糖的转化率随时间的延长而先增加再降低，在大肠杆菌生长至OD600nm为0.8时海藻糖的转化率最大，为66.47%。因此，发酵罐中大肠杆菌菌浓OD600nm为0.8时加乳糖诱导最佳。在菌体对数生长中期添加乳糖诱导效果最佳，不但可以获得较高的菌体浓度，还能得到较高的海藻糖合成酶，有利于提高海藻糖的转化率。

2.1.2诱导温度对转化率的影响

将活化后的大肠杆菌按接种量1%接种到15 L发酵罐中，在温度37℃、转速600 r/min、通气量7.5 L/min、pH 7.0的条件下发酵大肠杆菌。当罐中大肠杆菌菌浓OD600nm达0.8时，不同罐的温度分别设置为22℃、24℃、26℃、28℃、30℃时，流加终含量为0.2%的乳糖诱导8 h。下罐发酵液在10 000 r/min条件下离心10 min收集菌体，用50 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.0）洗涤菌体，并定容至原发酵液体积，配成菌悬液，匀浆机破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30 mL粗酶液和20 mL 75%的麦芽糖加入150 mL锥形瓶中55℃、120 r/min摇床中反应12 h，沸水浴10 min灭酶后测定海藻糖的转化率，结果见图2。

图2　诱导温度对转化率的影响Fig.2 Effect of induction temperature on conversion rate

由图2可知，海藻糖的转化率随温度的升高呈先增加再降低趋势，诱导温度控制在26℃时海藻糖的转化率最大，为68.25%。因此，发酵罐中诱导大肠杆菌产海藻糖合成酶的温度控制在26℃最佳。

2.1.3诱导时间对转化率的影响

将活化后的大肠杆菌按接种量1%接种到15 L发酵罐中，在温度37℃、转速600 r/min、通气量7.5 L/min、pH 7.0的条件下发酵大肠杆菌。当罐中大肠杆菌菌浓OD600nm达到0.8时，温度均降为26℃，流加终含量为0.2%的乳糖，分别诱导4 h、6 h、8 h、10 h、12 h。下罐发酵液在10 000 r/min条件下离心10 min收集菌体，用50 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.0）洗涤菌体，并定容至原发酵液体积，配成菌悬液，匀浆机破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30mL粗酶液和20mL75%的麦芽糖加入150mL锥形瓶中55℃、120r/min摇床中反应12 h，沸水浴10 min灭酶后测定海藻糖的转化率，结果见图3。

图3　诱导时间对转化率的影响Fig.3 Effect of induction time on conversion rate

由图3可知，随着诱导时间的延长，海藻糖的转化率先呈增加趋势，在诱导8 h时海藻糖的转化率达最大，为67.68%，随后有所降低。因此，即诱导时间8 h最佳。

2.1.4转化时间对转化率的影响

图4　转化时间对转化率的影响Fig.4 Effect of transforming time on conversion rate

将活化后的大肠杆菌按接种量1%接种到15 L发酵罐中，在温度37℃、转速600 r/min、通气量7.5 L/min、pH 7.0的条件下发酵大肠杆菌。当罐中大肠杆菌菌浓OD600nm达到0.8时，温度均降为26℃，流加终含量为0.2%的乳糖诱导8 h。下罐发酵液在10 000 r/min条件下离心10 min收集菌体，用50 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.0）洗涤菌体，并定容至原发酵液体积，配成菌悬液，匀浆机破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30 mL粗酶液和20 mL 75%的麦芽糖加入150 mL锥形瓶中55℃、120 r/min摇床中分别反应8 h、10 h、12 h、14 h、16 h，沸水浴10 min灭酶后测定海藻糖的转化率，结果见图4。

由图4可知，海藻糖的转化率随转化时间的延长先增加后趋于平稳，在转化12 h以后转化率增加不显著，根据经济效益考虑，转化时间12 h最佳。

2.2发酵条件优化正交试验

将上述4个条件的单因素试验进行正交分析，以海藻糖转化率为评价指标，确定正交试验4因素的水平范围。正交试验结果与分析见表2［16］，方差分析见表3。

表2　发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

表3　正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表2极差R的大小顺序可知，对海藻糖转化率影响的主次顺序为D＞B＞A＞C，即转化时间＞诱导温度＞菌浓OD600nm＞诱导时间，各因素的最优组合为A2B2C2D3，即最优搭配组合为菌浓OD600nm0.8时加诱导剂，诱导温度26℃、诱导时间8 h、转化时间14 h。在此最佳条件下，海藻糖转化率平均值为69.29%。

由表3可知，4个因素对结果均无显著影响。

3　结论

本试验通过乳糖诱导大肠杆菌产海藻糖合成酶将麦芽糖转化为海藻糖，经过单因素试验和正交试验，得知转化时间和诱导温度对转化率的影响较大，在大肠杆菌生长到菌浓OD600nm为0.8时加诱导剂，诱导温度26℃保持8 h，在转化过程中反应14h为最佳搭配。在最佳条件下，海藻糖的转化率可达69.29%。

大肠杆菌产海藻糖合成酶转化海藻糖工艺条件的优化可以提高海藻糖的转化率，而海藻糖合成酶在工业化生产海藻糖中具有良好的应用前景，因此大肠杆菌产海藻糖合酶转化海藻糖的条件优化，为海藻糖工业化大规模生产提供参考依据。

［1］黄日波.海藻糖-21世纪的新型糖类［M］.北京：化学工业出版社，2010.

［2］袁勤生.海藻糖的应用研究进展［J］.食品与药品，2005，7（4）：1-3.

［3］王自章，张树珍，杨本鹏，等.甘蔗农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株［J］.中国农业科学，2003，36（2）：140-146.

［4］李金花，张春艳，刘浩，等.海藻糖的特性及其在植物抗逆中的应用［J］.江西农业学报，2011，23（6）：25-27.

［5］韦航，蒙健宗，邓军.海藻糖在植物抗逆中的应用［J］.安徽农业科学，2009，37（20）：9355-9356.

［6］徐姗姗，朴美花，王艳姝.等.异氟醚对Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞氧化应激损伤的影响及海藻糖的保护作用［J］.吉林大学学报：医学版，2015，41（2）：207-212，437.

［7］RICHARDS A，KRAKOWKA S，DEXTER L，et al.Trehalose:a review of properties，history of use and human tolerance，and results of multiple safety studies［J］.Food Chem Toxicol，2002，40（7）:871-898.

［8］井瑞洁，王腾飞，王瑞明.海藻糖合酶研究进展［J］.中国酿造，2008，27（15）：1-4.

［9］KAUSHIK J K，BHAT R.Why is trehalose an exceptional protein stabilizer？An analysis of the thermal stabilityof proteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose［J］.J Biol Chem，2003，278（29）:26458-26465.

［10］MA Y，XUE L，SUN D W.Characteristics of trehalose synthase from permeablizedPseudomonas putidacells and its application in converting maltose into trehalose［J］.J Food Eng，2006，77（2）:342-347.

［11］曲茂华，张凤英，何名芳，等.海藻糖生物合成及应用研究进展［J］.食品工业科技，2014，35（16）：358-362.

［12］黄英，林芳，雷攀先，等.玫瑰链霉菌海藻糖合成酶基因克隆，表达及功能鉴定［J］.生物技术，2013，23（1）：11-16.

［13］高超，张山，何永志，等.改造大肠杆菌合成海藻糖途径以高效合成海藻糖［J］.生物工程学报，2015，31（12）：1-5.

［14］宿玲恰，张悦，吴敬.重组嗜热栖热菌海藻糖合酶制备海藻糖的工艺条件优化［J］.基因组学与应用生物学，2015，34（7）：1461-1467.

［15］赵伟，段莹莹，张曰辉，等.HPLC法检测海藻糖的研究［J］.中国酿造，2014，33（10）：148-150.

［16］张曰辉，张虎，曹大鹏，等.海藻糖转化条件优化的研究［J］.食品工业，2014，35（11）：96-98.

Optimization of fermentation conditions of trehalose synthase byEscherichia coli

YANG Meiyu，ZHAO Wei，CHEN Wenna，ZHANG Yuehui，CAO Dapeng
（Shandong Fuyang Biotechnology Co.，Ltd.，Dezhou 253100，China）

For confirming the optimal condition of the transformation efficiency of trehalose synthase fromEscherichia coli，the effect of bacterial concentration OD600nm，induction time and temperature，and transformation time on trehalose conversion rate was researched by single factor and orthogonal tests.The results showed that the transformation time and induction temperature had great influence on trehalose conversion rate.The optimal condition was as follows:inducer was added when OD600nmequals 0.8，induction temperature was maintained at 26℃for 8 h，and reaction time 14 h in the transformation process.The conversion rate of trehalose was as high as 69.29%under the optimal condition.

trehalose；trehalose synthase；Escherichia coli；fermentation conditions

TQ929

A

0254-5071（2015）10-0078-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.017

2015-09-04

山东福洋生物科技有限公司项目

杨梅玉（1987-），女，工程师，硕士，主要从事微生物发酵及酶技术工作。