胰蛋白酶水解谷朊粉制备多肽的工艺优化

刘玉婷，潘进权*，刘夏婷

（岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江524048）

胰蛋白酶水解谷朊粉制备多肽的工艺优化

刘玉婷，潘进权*，刘夏婷

（岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江524048）

为提高谷朊粉蛋白的加工性能及功能性质，考察了胰蛋白酶水解谷朊粉蛋白制备水溶性多肽的工艺。采用单因素及响应面试验法对影响谷朊粉蛋白酶解工艺的多个因素进行了分析，通过试验优化确定了谷朊粉蛋白适宜的酶解工艺条件为：谷朊粉蛋白质量浓度3 g/100 mL，加酶量为4 056 U/g，pH 11，温度48℃，时间为4 h。在优化的工艺条件下，谷朊粉蛋白的水解度可以达到8.03%，水溶性多肽得率为64.2%。试验结果表明，利用胰蛋白酶的水解作用将谷朊粉蛋白转化为水溶性的多肽具有可行性。

谷朊粉；胰蛋白酶；水解；多肽

谷朊粉俗称小麦面筋蛋白，它是将小麦面粉中的蛋白质经初步分离并烘干而获得的一种粉末状产品，其主要成分是蛋白质，含量高达70%～80%，主要由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，因其氨基酸组成较为合理，谷朊粉是一种营养价值较为丰富的天然植物蛋白质［1-2］。然而，由于谷朊粉蛋白肽链中含有较多的疏水性氨基酸，其分子内疏水作用区域较大，这导致该蛋白的水溶性及分散性能极差；此外，由于其分子内疏水相互作用太强导致其成膜性、起泡性及乳化性均较弱［3］。因此，谷朊粉蛋白在食品加工中推广应用受到了很大的限制。提高谷朊粉蛋白质的加工性能及功能性质是开发应用这一蛋白资源的关键。对此，国内外已有一些有关谷朊粉蛋白质的化学改性［4-6］、物理改性［7-8］及酶促改性［9-10］的相关研究报道。

从谷朊粉蛋白的结构特点来看，制约该蛋白加工性能及功能性质的关键是其水溶性太差，改善其水溶性是解决问题的关键［11-12］。已有的大量研究表明，蛋白质经初步酶解后得到的多肽往往具有优良的水溶特性，其乳化性、起泡性也可以得到很好的改善［13］；此外，蛋白质经酶解制备的多肽通常具有多种多样的生理功能，如参与机体免疫调节、抗氧化、降血压、促进矿物质吸收及抗血栓等［14-15］，已成为筛选药物、制备功能性食品和食品添加剂的天然资源宝库［16-18］。因此，利用蛋白酶对谷朊粉蛋白的酶解作用将其转化为水溶性多肽即可以解决其固有的加工性能之缺陷，同时又可以拓宽该植物蛋白的应用领域。鉴于此，本研究将以谷朊粉蛋白水解及水溶性多肽的高效制备为目标对谷朊粉的酶解工艺进行了探讨，并采用响应面分析的方法对工艺条件进行了优化，其研究结果将为谷朊粉蛋白多肽的工业生产提供指导。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

谷朊粉（蛋白质含量70.53%）：华森食品配料有限公司；胰蛋白酶（酶活力73 907.6 U/g）：国药集团化学试剂有限公司；实验过程中用的化学试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

SKD-08S2红外智能消化炉、SKD-600自动凯氏定氮仪：上海沛欧分析仪器有限公司；723N可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；HH-601超级恒温水浴锅：江苏金坛市亿通电子有限公司；LXJ-IIB飞鸽牌系列离心机：上海安亭科学仪器厂；pHS-3C+酸度计：成都世纪方舟科技有限公司；TH-300A梯度混合器：上海青浦泸西仪器厂；GZX-9140 MBE数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LGJ-18型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂；2XZ-4型旋片式真空泵：上海德英真空照明设备有限公司。

1.3试验方法

1.3.1谷朊粉的酶解工艺流程

谷朊粉液→调节pH值→加入胰蛋白酶→保温酶解→沸水浴灭酶→离心分离→蛋白水解液

操作要点：用蒸馏水配制蛋白质量浓度为50 g/L的谷朊粉液，调节其pH值为8.0，按照2 500 U/g蛋白的加酶量加入胰蛋白酶，混匀后置于45℃水浴中保温酶解3 h；将酶解液在100℃水浴中灭酶10min，于8000 r/min条件下离心10min，收集上清液即得到蛋白水解液。

1.3.2测定方法

粗蛋白含量、总氮的含量及多肽含量的测定采用凯氏定氮法［19］；蛋白酶活力标定：采用Folin-酚法［20］；氨基酸态氮的含量的测定采用甲醛滴定法［21］，蛋白质水解度（degree of hydrolysis，DH）及多肽得率的计算公式如下：

式中：N1为蛋白水解过程中生成的氨基酸态氮的含量，g/g谷朊粉；N2为样品中总氮的含量；g/g谷朊粉。

式中：M1为水解液中多肽含量，g/mL；M2为水解液中蛋白质含量，g/mL。

1.3.3酶解工艺的单因素试验

底物质量浓度对酶解工艺的影响：配制蛋白质量浓度分别为10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L的谷朊粉溶液，按照1.3.1所述方法进行酶解，测定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察底物蛋白质量浓度对酶解工艺的影响。

酶用量对酶解工艺的影响：按照1.3.1所述方法，分别在1 200 U/g、1 600 U/g、2 000 U/g、2 400 U/g、2 800 U/g、3 200 U/g蛋白的加酶量下进行酶解试验，测定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察加酶量对酶解工艺的影响。

酶解时间对酶解工艺的影响：按照1.3.1所述方法，分别在不同时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h）条件下进行酶解试验，测定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察酶解时间对酶解工艺的影响。

pH值对酶解工艺的影响：按照1.3.1所述方法，分别在不同pH（6、7、8、9、10、11、12）条件下进行酶解试验，测定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察pH值对酶解工艺的影响。

酶解温度对酶解工艺的影响：按照1.3.1所述方法，分别在不同温度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）条件下进行酶解试验，测定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察温度对酶解工艺的影响。

1.3.4酶解工艺的响应面试验分析

根据上述单因素试验的结果及分析，初步确定了影响谷朊粉酶解工艺的主要因素以及各因素的适宜取值范围。以加酶量、酶解温度及pH值3个因素为变量，分别以水解度（Y1）及多肽得率（Y2）为响应值，采用响应面分析法中的中心组合设计对这3个因素做进一步考察并优化，由此确定它们的最佳取值，进而确定最佳的酶解工艺条件，因素与水平见表1。

表1　中心组合设计因素与水平Table 1 Factors and levels of central composite design

2　结果与分析

2.1单因素试验分析

2.1.1底物蛋白质量浓度对酶解工艺的影响

在其他条件不变的前提下，分别以不同质量浓度的谷朊粉蛋白进行酶解试验，考察了蛋白质量浓度对酶解工艺的影响，结果如图1所示。

图1　底物蛋白质量浓度对酶解工艺的影响Fig.1 Effect of protein concentration on the hydrolysis process of wheat gluten

由图1可知，在试验的质量浓度范围之内，当蛋白质量浓度低于4 g/100 mL时，蛋白水解度受底物质量浓度的影响并不明显，这说明在此试验条件下原蛋白肽链中能够被作用的肽键已水解完全；当蛋白质量浓度＞4 g/100 mL，水解度会随着蛋白质量浓度的增加而降低，说明原蛋白肽链上部分能够被作用的肽键并没有被水解，这是由于谷朊粉蛋白难溶于水，过高的质量浓度会造成蛋白分散困难，甚至结团从而直接影响其水解效率。另外，试验还发现水溶性多肽的得率与蛋白水解度的变化趋势基本相一致，并与蛋白质量浓度有一定关系，酶解体系中蛋白质量浓度太高（＞3 g/100 mL）将会导致多肽得率明显降低。综合考虑水解度及多肽得率两个指标，确定了酶解工艺适宜的谷朊粉蛋白质量浓度为3 g/100 mL。

2.1.2加酶量对水解度的影响

在酶解体系中分别加入不同量的胰蛋白酶进行谷朊粉酶解试验，考察了加酶量对酶解工艺的影响，试验结果如图2所示。

图2　加酶量对酶解工艺的影响Fig.2 Effect of enzyme addition on the hydrolysis process of wheat gluten

由图2可知，在试验条件下谷朊粉蛋白的水解度及多肽得率随加酶量的增加而显著增加，当加酶量＞3 500 U/g时，水解度与多肽得率增加趋于平缓，说明原蛋白肽链中能够被作用的肽键已基本水解完全。因此，初步确定酶解体系中胰蛋白酶的适宜添加量在3 500 U/g左右。

2.1.3酶解温度对酶解工艺的影响

分别在不同的温度条件下进行谷朊粉酶解试验，考察了酶解温度对酶解工艺的影响，结果如图3所示。

图3　酶解温度对酶解工艺的影响Fig.3 Effect of hydrolyzing temperature on the hydrolysis process of wheat gluten

由图3可知，当酶解体系温度＜50℃时，随着酶解温度的升高蛋白水解度及多肽得率随之增加；当酶解体系温度＞55℃时，蛋白水解度会迅速下降，说明在此温度条件下酶失活严重。因此，初步确定谷朊粉酶解的适宜酶解温度在50℃左右。

2.1.4pH值对酶解工艺的影响

在不同的pH值条件下进行谷朊粉酶解试验，考察了pH值对酶解工艺的影响，试验结果如图4所示。

图4　pH对酶解工艺的影响Fig.4 Effect of pH on the hydrolysis process of wheat gluten

由图4可知，在pH值＜8的情况下，蛋白水解度及多肽得率随pH的增加呈现缓慢增加趋势；当体系pH值为8～11时，蛋白水解度及多肽得率随pH值升高迅速增加；当体系pH值＞11时，蛋白水解度及多肽得率的增加又趋于平缓；碱性的环境有助于谷朊粉蛋白的水解，这可能与谷朊粉蛋白在碱性条件下相对较好的水溶性有关［22］。因此，初步确定了胰蛋白酶水解谷朊粉蛋白的适宜pH值在11左右。

2.1.5酶解时间对酶解工艺的影响

分别在不同的时间范围内进行谷朊粉酶解试验，考察了酶解时间对酶解工艺的影响，试验结果如图5所示。

图5　酶解时间对酶解工艺的影响Fig.5 Effect of hydrolyzing time on the hydrolysis process of wheat gluten

由图5可知，在酶解时间＜4 h时，蛋白水解度及多肽得率随着酶解时间的延长而逐渐增加，说明这此时间范围内蛋白肽链上可被作用的肽键并未完全水解，酶解不充分；当酶解时间＞4 h后，蛋白水解度及多肽得率的增加不明显，说明在此试验条件下酶解已结束。因此，谷朊粉蛋白酶解的适宜时间为4 h。

2.2酶解工艺的中心组合试验设计

在单因素试验的基础上，固定谷朊粉蛋白质量浓度为3 g/100 mL，酶解时间为4 h，以水解度（Y1）及多肽得率（Y2）为响应值，采用响应面分析法中的中心组合试验对这3个因素进行响应面优化设计，试验设计及结果如表2所示。

分别以水解度及多肽得率为响应值对表2试验结果进行回归分析，可以拟合得到以下数学模型：

表2　中心组合试验设计及结果Table 2 Central composite design and experimental results

由表3方差分析可知，该模型的P=0.000 1，失拟项P=0.142 8，表明拟合得到的模型极显著，失拟不显著；相关系数R2=0.960 4，说明该模型可以解释96.04%的试验结果，模型拟合度非常高，可以用于说明试验因素与响应值之间的关系。此外，在考察的3个因素中，因素A与因素C对试验结果有极显著影响（P＜0.01），因素B对试验结果有显著影响（P＜0.05）；在各因素设定的取值范围内，3个因素对响应值（Y1）的影响强弱依次为A＞C＞B。

表3　回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

以谷朊粉蛋白水解度（Y1）为响应值，在固定一个因素取值为0水平的前提下，绘制模型（1）的响应面图，结果如图6所示。

图6　加酶量（A），温度（B）与pH（C）交互作用对谷朊粉蛋白水解度影响的响应面Fig.6 Response surfaces plots and contour line of effects of interaction between enzyme addition，temperature and pH on hydrolysis degree of wheat gluten

由图6可知，模型确定的响应曲面是典型的凸面，在该曲面上必然存在最大响应点，与之对应的各因素取值分别为加酶量（A）4 056 U/g，温度（B）48.2℃，pH值（C）为11.13。此条件下理论谷朊粉蛋白水解度为（8.09±0.19）%，多肽得率为（65.03±1.71）%。考虑到实际操作的方便，将各因素修正为加酶量4 056 U/g，温度48℃，pH值为11。在修正条件下进行4次重复验证试验，谷朊粉蛋白水解度结果的平均值为8.03%，多肽得率为64.2%，与模型预测值基本一致，进一步验证了该模型的可靠性。

3　结论

本研究以谷朊粉蛋白水解及水溶性肽的制备为目标，考察了影响胰蛋白酶水解谷朊粉蛋白的工艺条件：底物蛋白浓度、加酶量、温度、pH值及酶解时间。采用响应面分析法对酶解工艺进行了优化并确定了最佳的谷朊粉酶解工艺条件为谷朊粉蛋白质量浓度3 g/100 mL，加酶量为4 056 U/g，pH 11，酶解温度48℃，酶解时间为4 h。在此优化的工艺条件下，谷朊粉蛋白的水解度可以达到8.03%，水溶性多肽得率达到64.2%。试验结果表明，胰蛋白酶对谷朊粉蛋白有相对较强的水解能力，通过胰蛋白酶的作用可显著提高谷朊粉蛋白的水溶性，从而提高该蛋白原料的加工性能。

［1］徐颖，汪璇，刘小丹，等.谷朊粉的功能特性及应用现状［J］.粮食与饲料工业，2010（10）：29-31.

［2］付博菲，刘晓，徐绍建，等.谷朊粉的功能特性及改性研究［J］.中国食物与营养，2012，18（9）：35-37.

［3］刘延奇，郭妤薇.谷朊粉改性技术研究进展［J］.粮食与食品工业，2007，14（1）：23-26.

［4］张龙，史吉平，杜风光，等.小麦面筋蛋白化学改性研究进展［J］.粮食加工，2006，31（6）：56-58.

［5］LAGRAIN B，BRIJS K，DELCOUR J A.Impact of redox agents on the physico-chemistry of wheat gluten proteins during hydrothermal treatment［J］.J Cereal Sci，2006，44（1）:49-53.

［6］任仙娥，杨锋，曹燕，等.糖基化改性对谷朊粉功能性质的影响［J］.粮食与饲料工业，2013（4）：30-33.

［7］黄达伟，马宁，杜喜坤.超声对小麦面筋蛋白功能性质的影响［J］.食品与发酵科技，2014，50（3）：42-45.

［8］HAYTA M，ALPASLAN M.Effects of processing on biochemical and rheological properties of wheat gluten proteins［J］.Food，2001，45（5）: 304-308.

［9］YIE H Y，SHOTARO Y，YASUKI M.Effects of Enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of wheat gluten［J］.J Agr Food Chem，2006，54（16）:6034-6040.

［10］BRIJS K，DELVAUX F，VIKY G，et al.Solubilisation and degradation of wheat gluten proteins by barley malt proteolytic enzymes［J］.J I Brewing，2002，108（3）:348-354.

［11］金华丽，何健，张龙.面筋蛋白增溶作用研究进展［J］.郑州工程学院学报，2002，23（2）：95-97.

［12］唐小君，李梦琴.复合改性对谷朊粉溶解性的影响研究［J］.粮食与饲料工业，2012（8）：26-29.

［13］齐军茹，王兰，李瑜.中性蛋白酶对小麦面筋蛋白的水解改性研究［J］.郑州工程学院学报，2001，22（4）：46-49.

［14］王章存，王颖，曹芹，等.谷朊粉酶解物的制备及其ACE抑制肽的分离鉴定［J］.中国酿造，2015（2）：60-63.

［15］王章存，原媛，王许东，等.谷朊粉酶解条件优化及其抗氧化活性［J］.中国粮油学报，2014，29（11）：7-13.

［16］孔祥珍，周惠明，钱海峰.小麦面筋蛋白短肽的镇痛作用研究［J］.食品与生物技术学报，2007，26（2）：26-29.

［17］HARTMANN R，MEISE H.Food-derived peptides with biological activity:from research to food applications［J］.Curr Opin Biotech，2007，18（2）:163-169.

［18］KORHNEN H，PIHLANTO A.Food derived bioactive peptides opportunities for designing future foods［J］.Curr Pharm Design，2003，9（16）:1297-1308.

［19］中华人民共和国国家技术质量监督检验总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 23527—2009蛋白酶制剂［S］.北京：中国标准出版社，2009.

［20］中华人民共和国国家技术质量监督检验总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.5—2010食品中蛋白质的测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［21］赵新淮，冯志彪.大豆蛋白水解物水解度测定的研究［J］.东北农业大学学报，1995，26（2）：178-181.

［22］JIN H L，WANG J S，BIAN K.Characteristics of enzymatic hydrolysis of the wheat gluten proteins treated by ultrasound wave［J］.Adv Mater Res，2011，344:1015-1022.

Optimization of polypeptides preparation process from wheat gluten by trypsin hydrolysis

LIU Yuting，PAN Jinquan*，LIU Xiating
（School of Life Science and Technology，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048，China）

To improve the processing and functional properties of wheat gluten protein，the preparation process of polypeptides from wheat gluten protein by trypsin hydrolysis was investigated and optimized through single factor and response surface method.After optimization，the optimum process conditions for the enzymatic hydrolysis of wheat gluten protein were determined:wheat gluten protein concentration 3 g/100 ml，trypsin addition 4 056 U/g，pH 11，temperature 48℃，time 4 h.Under the conditions，the hydrolysis degree of wheat gluten protein could reach 8.03%，and the yield of water soluble polypeptides was 64.2%.The experimental results showed that the process for the transformation of gluten protein into water soluble polypeptides by trypsin hydrolysis was feasible.

wheat gluten；trypsin；hydrolysis；polypeptides

TS201.1

A

0254-5071（2015）10-0018-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.005

2015-09-16

国家星火计划项目（2013GA780084）；广东省科技计划项目（2015A010107016）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310579014）

刘玉婷（1990-），女，助教，本科，研究方向为食品生物技术。

潘进权（1978-），男，博士，副教授，研究方向为食品生物技术。