皮肤组织块培养获取原代细胞的实验观察

朱静,张汝芝,程赛,,金慧玲

皮肤组织块培养获取原代细胞的实验观察

朱静1,张汝芝2,程赛1,2,金慧玲1

(1.蚌埠医学院第一附属医院皮肤性病科安徽蚌埠233004;2.苏州大学附属第三医院皮肤性病科江苏常州213003)

目的:从皮肤组织块培养获取原代细胞.方法:将皮肤组织块修剪成2mmX2mm大小,放置到培养皿中,真皮层向下,观察细胞爬出的情况.结果:组织块培养第3天,有角质形成细胞从组织块爬出,第7天左右组织块周围出现黑素细胞,随着培养时间的延长,组织块周围出现大量成纤维细胞.结论:在组织块培养过程中,早期可以收集较纯的角质形成细胞,含血清的DMEM培养20d后,可以得到大量成纤维细胞.

组织块培养;原代细胞;前体细胞

皮肤原代细胞的获得与培养对于基础和临床研究有着重要的意义.然而,通过中性蛋白酶和胰酶消化将表皮细胞游离,然后进行细胞的贴壁培养,继而经差别胰酶消化将细胞纯化,得到的角质形成细胞容易受到成纤维细胞的污染.在本实验中,通过皮肤组织块的培养方法,通过不同细胞从组织块爬出的时间不同,探索获得原代细胞的方法.

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1包皮:包皮环切术中的包皮组织(提供者为18岁健康男性)

1.1.2试剂:中性蛋白酶(sigma),0.05%及0.25%的胰酶/0.53mmol/L EDTA(吉诺生物公司),人黑素细胞培养基(Medium 254)及黑素细胞生长添加成分( human melanocyte growth supplement,HMGS)(包含5μg/ml胰岛素,50μg/ml维生素C,6mmol/L L-谷氨酰胺,0.20mmol/L氯化钙等),人表皮细胞无血清培养基,角质形成细胞生长添加成分(human keratinocytegrowthsupplement,HKGS) (0.18μg/ml氢化可的松、0.20ng/ml EGF、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素和8μg/ml霍乱毒素)(美国Invitrogen公司),胎牛血清(四季青)(浙江天航生物科技有限公司),兔抗人Vimentin单克隆抗体(福州迈新生物科技有限公司),GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(上海基因科技有限公司).

1.2方法

1.2.1组织块培养:碘伏浸泡包皮标本10min,磷酸盐缓冲液(PBS,含400 U/ml青霉素和400U/ml链霉素)将碘伏冲洗干净,修剪皮下组织,在接近表真皮交界处,将皮肤组织块剪成约2mmX2mm大小,放置到培养皿中,真皮层向下.将含有20%胎牛血清的DMEM少量分别滴加到组织块表面,液体量刚好将组织块浸润,置入37℃孵箱中.第2天,待组织块贴紧培养皿底壁后,添加的液体换成含HKGS的表皮细胞培养基(不含血清).每天适当添加培养基,使得组织块不会因液体少而干,而不会因液体多而漂浮,分别观察组织块的变化.

1.2.2细胞爬片:组织块培养20d后,将残余的组织块挑除,胰酶消化贴壁的细胞,中和后获得单细胞悬液,重新种植并进行部分细胞爬片.爬片3d后,细胞贴壁生长,进行免疫细胞化学染色.

1.2.3免疫细胞化学染色:PBS润洗细胞爬片,4%多聚甲醛固定10min,PBS冲洗,0.1%的triton-100溶液细胞通透10min,PBS冲洗,20%的胎牛血清室温下封闭20～30min,PBS冲洗,加一抗Vimentin抗体(1:50稀释),4℃过夜,复温30min,PBS冲洗,含HRP的通用型二抗孵育30min,PBS冲洗,DAB显色液显色,显微镜下观察,终止,摄片.

图1　组织块培养第5天,角质形成细胞爬行到组织块周围

图2　第7天有树突状细胞从角质形成细胞的间隙爬出

图3　树突状细胞成簇爬出

图4　树突状细胞成团分布

2　结果

2.1细胞生长情况

培养皿中组织块培养第3天开始,有角质形成细胞爬出,随着时间的延长,细胞爬行到离组织块的距离越远(见图1).培养7d左右,有树突状细胞爬出,树突状细胞在角质形成细胞间隙中爬行,甚至游离到超出角质形成细胞的范围(见图2),可以推断为黑素细胞.部分树突状细胞呈簇状从组织块周围爬出,细胞多呈现双树突,棒槌样(见图3),穿过角质形成细胞,部分呈细胞成团样分布(见图4).

2.2组织块培养20d后

随着含血清的DMEM培养基培养组织块时间的延长,逐渐出现细胞网状生长,培养20d后,大量梭形细胞,形态难以区别是黑素细胞还是成纤维细胞(见图5).胰酶消化获得单细胞悬液贴壁生长后进行免疫细胞化学染色,结果示:细胞呈不规则网状分布,波形蛋白抗体染色阳性(见图6),可以表明细胞均为成纤维细胞.

图5　组织块培养20d后,大量梭形细胞

图6　波形蛋白染色阳性

3　讨论

在本实验中,皮肤组织块培养第3天左右,角质形成细胞从组织块周围爬出,无其他细胞混杂,此时胰酶消化可以得到较为纯净的角质形成细胞,不受成纤维细胞污染.这种皮肤组织块培养法可以获取原代角质形成细胞,用于大面积烧伤的治疗[1].获取人原代角质形成细胞的方法有两种,Medawar等人提出的中性蛋白酶将表真皮层分离然后游离表皮细胞[2],或者是组织块培养获得[3].前种方法能较快获取细胞悬液,贴壁培养后再进行纯化,然而纯化得到的角质形成细胞仍然容易受到成纤维细胞的污染.而且有实验者通过比较两种方法获取髌韧带细胞后比较细胞生长差异很大[4].

在本实验中,组织块开始有角质形成细胞爬出,但是经过含血清的培养基,具有筛选作用,从而获得大量成纤维细胞,而获取成纤维细胞,可以用来研究疾病,也可以作为重编程产生多潜能细胞的来源[5].

组织块培养第7～10天,有树突状细胞爬出,部分成细胞团样生长,且能移行到组织块周围,可以推断细胞增殖、迁移能力很强,具有细胞前体的一定特点.Aihua Guo等人通过组织块培养获得的角质形成细胞具有表达K5、K6等细胞前体的标记物,证实了其具有细胞前体的特点[6].组织块培养法获得大鼠视网膜干细胞[7],用于扩增人脂肪源性干细胞[8],分离获得皮肤和肺组织的间质细胞前体[9],用于分离毛囊bulge区细胞[10]等这些实验表明组织块培养法将会是获得细胞前体较为简单方法,更有利于观察这些细胞前体的生物学特征.

[1]Auxenfans C,Shipkov H,Bach C,et al.Cultured allogenic keratinocytes for extensive burns:a retrospective study over 15 years[J].Burns,2014,40(1):82-88.

[2]Medawar PB.Sheets of pure epidermal epithelium from human skin[J].Nature,1941,148:783.

[3]Minasi MG,Riminucci M,De Angelis L,et al.The mesoangioblast:a multipotent,self-renewing cell that originates fromthedorsalaortaanddifferentiatesintomost mesodermaltissues[J].Development,2002,129(11):2773-2783.

[4]沈晓涛,陈斯韵,赵宝寅,等.组织块培养法和酶消化法分离髌韧带细胞的比较[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(46):8563-8567.

[5]Vangipuram M,Ting D,Kim S,et al.Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts [J].Vis Exp,2013(77):e3779.

[6]GuoA,JahodaCA.Animprovedmethodofhuman keratinocyte culture from skin explants:cell expansion is linkedtomarkersofactivatedprogenitorcells[J].Exp Dermatol,2009,18(8):720-726.

[7]齐首楠,苏冠方,王晨光,等.应用组织块培养法对大鼠视网膜干细胞进行分离培养及鉴定[J].国际眼科杂志,2010,10

(9):1665-1667.

[8]彭智,陈琦,贾振华,等.组织块培养法扩增人脂肪源性干细胞的生物学特征鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(36):6689-6694.

[9]Bernal A,Fernandez M,Perez LM,et al.Method for obtaining committed adult mesenchymal precursors from skin and lung tissue[J].PLoS One,2012,7(12):e53215.

[10]王慧君,柏树令,田伟,等.bulge区毛囊组织块培养结合酶消化法分离大鼠毛囊隆突部细胞的生物学特征[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(20):3806-3809.

编辑/张惠娟

The observation of skin explants culture to harvest primary cell

ZHU Jing1,ZHANG Ru-zhi2,CHENG Sai1,2,JIN Hui-ling1
(1.Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu 233004,Anhui,China;2.Department of Dermatology,The Third Affiliated Hospital of Suzhou University, Changzhou 213003,Jiangsu,China)

Objective To harvest primary cells from skin explants culture.Methods Skin explants in size of 2mmX2mm were obtained by using sharp scissors,each skin explant placed onto the bottom of culture dish,and they were oriented with the epidermis facing up,then observe the cells migrating from the explants.ResultsFrom the third day,keratinocytes migrating from the explants,then melanocytes appear around the explants.As culture time getting longger,a large number of fibrolasts around the explant.Conclusion During the explant culture,we could harvest keratinocyte without contamination firstly,and DMEM contain serum culture for 20days,could harvest a large number of fibrolasts.

explants culture;primary cell;cell progenitors

Q813.1

A

1008-6455(2015)06-0034-03

国家自然科学基金课题(项目编号:81171516)

张汝芝,主任医师,苏州大学附属第三医院皮肤性病科,江苏常州,邮编:213003,E-mail:zhangruzhi628@163.com

2015-01-10

2015-02-03