大气细颗粒物对小鼠皮肤组织中表皮生长因子受体mRNA表达的影响

韩雪,梁文艳,梁文丽,张苑,孙乐栋

.基础研究.

大气细颗粒物对小鼠皮肤组织中表皮生长因子受体mRNA表达的影响

韩雪1,梁文艳2,梁文丽1,张苑1,孙乐栋1

(1.南方医科大学珠江医院广东广州510280;2.北京林业大学资源与环境学院北京100083)

目的:研究大气细颗粒物对小鼠皮肤组织表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)mRNA表达的影响,以探讨大气细颗粒物对皮肤老化的影响.方法:将40只BALB/c雌性小鼠随机分成生理盐水对照组及大气细颗粒物(PM2.5)染毒低、中、高剂量(分别为1.6、8.0和40.0mg/kg)组,每组10只.各剂量组均经气管滴注染毒3d.末次染毒24h后,采用实时荧光定量PCR方法分别检测各组小鼠皮肤组织EGFRmRNA的表达量.结果:与对照组相比,PM2.5染毒中、高剂量组EGFRmRNA的表达量均明显升高(P<0.05),且与剂量呈正相关.结论:中、高浓度PM2.5可以诱导EGFRmRNA的表达,促进皮肤老化的发生.

大气细颗粒物;表皮细胞生长因子受体;实时荧光定量PCR

皮肤衰老是随着增龄而出现的皮肤生理结构紊乱及功能退化的复杂过程,其同时受到内在因素和外在因素的综合影响,一般表现为自然衰老和光老化两种形式[1].自然衰老主要受遗传等内源性因素影响,随时间流逝而逐渐显现,多表现在皱纹细浅,皮肤干燥、松弛和粗糙[2].皮肤覆盖体表,是人体与外界交流联系的最重要窗口,在衰老时极易暴露,直接引起焦虑、抑郁、自卑等一系列的心理和社会问题,对人们的生活、工作带来严重影响.因此,预防和延缓皮肤衰老成为当今医学研究的热点之一[3].

表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在皮肤老化的形成中是一个早期事件,在皮肤老化的过程中处于关键性的作用[4].空气颗粒物污染和皮肤老化之间的关系是环境流行病学研究的热点之一,但具体机制尚未明了.本实验通过研究大气细颗粒物对小鼠皮肤组织EGFR mRNA表达的影响,探讨其可能的影响机制.

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物:BALB/c雌性小鼠40只(由南方医科大学动物实验中心提供),体重18～20g.

1.1.2主要仪器和试剂:主要试剂包括:QIAEⅡAgarose Gel Extraction Protocal(德国Qiagen公司产品)RNA提取试剂,RT-PCR试剂,逆转录酶(Invitrogen公司产品)等.主要仪器包括Thenmo Anderson G-2.5大流量采样器(美国热电公司)、紫外分光光度计(美国bio-Rad公司)、Stratagene Mx3000P Real time PCR仪(美国Agilent公司产品)等.

1.1.3引物序列:利用TRIZ0L提取基因组,设计并合成EGFR引物:上游引物:5'-AGCTCACGCAGTTGGGCA-3'.下游引物:5'-TCTCATGGGCAGCTCCTT-3'.

1.2方法

1.2.1PM2.5来源和处理:在广州市海珠区某建筑物楼顶(周围无明显污染源,高12.2m)使用Thenmo Anderson G-2.5大流量采样器采集2014年8月-9月的大气PM2.5.将采有PM2.5的滤膜剪成1cm2大小,用三蒸水浸泡,超声振荡30min后,用六层纱布过滤PM2.5震荡液,连续浸泡、震荡、过滤3次,真空冷冻干燥滤液成干粉,保存4℃冰箱中备用.临用前称取一定量PM2.5干粉,在超净台中加入DMEM培养溶液(Gibco公司)超声震荡15min混匀并灭菌,配制成不同浓度的PM2.5溶液备用.

1.2.2动物分组及染毒:将40只BALB/c雌性小鼠随机分成生理盐水对照组及大气细颗粒物(PM2.5)染毒低、中、高剂量(分别为1.6、8.0和40.0mg/kg)组,每组10只.各剂量组均经气管滴注染毒,滴注体积为1.5ml/kg,连续染毒3d,每次间隔24h.

1.2.3皮肤组织RNA的提取:用Trizol法,按照说明书从各组小鼠背部皮肤组织中常规提取RNA,-80℃冻存备用. 1.2.4实时荧光定量PCR检测:逆转录合成cDNA,以2μg总RNA为模板,按照PrimeScript®1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)说明书配制逆转录反应体系,总体系为20μl,合成cDNA.荧光定量RT-PCR的条件优化:对Mg2+、引物等浓度进行优化.

Real time PCR扩增的反应体系为25μl (TAKARA SYB®Premix Ex Taq kit)按照:95℃30s,95℃5s,60℃30s,40循环,用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪Mx3000P进行荧光定量PCR实验.

1.3统计学方法

分别做Wilcoxon秩和检验,SPSS17.0软件分析,结果中数据以"median(P25～P75)"表示, P<0.05时为差异有统计学意义.

2　结果

2.1实时荧光定量PCR结果

皮肤组织中PM2.5染毒中、高剂量EGFR mRNA的表达量均高于对照组,且与剂量呈正相关,见表1和图1.

表1　皮肤组织中EGFR mRNA的表达水平

图1　大气细颗粒物浓度与EGFR mRNA表达的相关性分析表

2.2不同浓度PM2.5与EGFR mRNA的表达量的相关性分析

不同浓度PM2.5与皮肤组织EGFR mRNA的表达量存在正相关(Kendall's tau_b:r=0.784,P=0.000; Spearman's rho:r=0.903,P=0.000),r>0.40,两者相关性显著.

3　讨论

研究发现,EGFR的高表达与人体皮肤老化的关系密切.其不仅是皮肤老化过程中的一个早期事件,也可以作为一种判断皮肤老化的早期指标[4-5], Xu等[6]最新研究显示,中波紫外线照射永生化角质形成细胞,能够使得c-jun,c-fos表达增高,而照射给予EGFR拮抗剂,这种趋势被显著减轻.这充分提示EGFR在皮肤老化中起重要作用.

大气中粒径小于或等于2.5μm,即PM2.5的颗粒物,称为细颗粒物,又称细粒、细颗粒.大量研究表明,PM2.5含有大量的有毒、有害物质且在大气中的停留时间长、输送距离远,不仅对人体健康和大气环境质量有影响,更对人体的皮肤有影响,这些物质依附在皮肤上,导致皮肤的代谢循环受到影响,引起黑头、毛孔粗大、角质堆积、皮肤老化等现象.本实验结果显示:PM2.5染毒低浓度剂量组EGFR mRNA的表达量与对照组比较,差异无统计学意义,而暴露于中、高浓度PM2.5环境下的小鼠皮肤出现老化现象,且中、高浓度PM2.5可以诱导EGFR mRNA的表达,并与剂量呈正相关.这可能是因为皮肤组织对一定浓度内的PM2.5有防御功能,但超过一定浓度后,皮肤组织的防御功能破坏,导致EGFR mMRA高表达.因此阻断EGFR,有可能消除或极大减弱PM2.5引起的皮肤老化.

[1]Fisher GJ,Kang S,Varani J,et al.Mechanisms of photoaging and chronological skin aging[J].Arch Dermatol,2002,138 (11):1462-1470.

[2]郭丽红,吴景东,魏锦富.黄芪对D-半乳糖致小鼠衰老模型作用的实验研究[J].中国美容医学,2012,21(12):2313-2314.

[3]Knezevic D,Zhang W,Rochette PJ,et al.Bcl-2 is the targer of a UV-inducible apoptosis switch and a node for UV signaling [J].Proc NatlAcad Sci,2007,104(27):11286-11291.

[4]Hachiya A,Sriwiriyanont P,Fujimura T,et al.Mechanistic effectsoflong-termultravioletBirradiationinduce epidermal and dermal changes in human skin xenografts[J]. Am J Pathol,2009;174(2):401-413.

[5]Sakurada A,TsaoMS.PredictivebiomarkersforEGFR therapy[J].Drugs,2009,12(1):34-38.

[6]XuY,Voorhees JJ,Fisher GJ.Epidermal growth factor receptor isacriticalmediatorofultravioletBirradiation-inducedsignal transduction in immortalized human keratinocyte HaCaTcells [J].AmJPathol,2006,169(3):823-830.

编辑/张惠娟

The influence of atmospheric fine particles on the expression of EGFR mRNA in mouse skin tissue

HAN Xue1,LIANG Wen-yan2,LIANG Wen-li1,ZHANG Yuan1,SUN Le-dong1
(1.Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou,510282,Guangdong,China;2.College of Environmental Science&Engineering,Beijing 100083,China)

Objective To study the influence of atmospheric fine particles on the expression of EGFR mRNA in mouse skin tissue and to explore the influence of atmospheric fine particles of skin aging. Methods 40 female BALB/c mice were randomly divided into 4 groups including 1 saline control group and 3 PM2.5 exposure groups(1.6,8.0 and 40.0mg/kg body weight,respectively).Each exposure group received intratracheal instillation once per day for 3 consecutive days.At the 24h after the last administration,skin tissueand were collected to detect the expression of EGFR mRNA by realtime fluorescent quantitative PCR.Results Compared with control group,the expression of EGFR mRNA increased significantly in the 8.0 and 40.0mg/kg PM2.5 exposure groups(P<0.05),and positively related to dosage of PM2.5.Conclusion The 8.0 and 40.0mg/kg PM2.5 exposure can induce the expression of EGFR mRNA and promote the occurrence of skin aging.

atmospheric fine particles;epidermal growth factor receptor;Real-Time PCR

Q813.1

A

1008-6455(2015)06-0032-02

孙乐栋,男,主任医师,南方医科大学珠江医院皮肤科主任;长期从事抗衰老的临床和研究工作;

E-mail:sunledong126@126.com

2014-12-16

2015-03-16