双酶法预处理对菜籽饼多酚提取的影响

熊俐，谷良富

（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

双酶法预处理对菜籽饼多酚提取的影响

熊俐，谷良富

（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

用纤维素酶和蛋白酶对菜籽饼进行复合预处理，然后用乙醇浸提其中的多酚，研究酶解对多酚提取率的影响。结果表明双酶法预处理的最佳条件为：纤维素酶添加量1.4%，蛋白酶添加量0.7%，反应温度50℃，反应时间3 h，酶解初始pH5.4，多酚的得率为3.12%。较之非酶解法，双酶法对多酚的提取率提高了约54.46%。

菜籽饼；多酚；纤维素酶；蛋白酶；提取

油菜籽是世界第三大油料作物。我国年产油菜籽1 100万t～1 200万t，油菜籽经压榨制油后产生的菜籽饼每年超过500万t，居世界首位[1-2]。茶籽饼中富含蛋白质、糖类、粗纤维及矿物质，同时含有硫代葡萄糖苷、植酸及单宁等多酚类物质。多酚类物质会与蛋白、金属离子等营养物质相结合，降低菜籽饼的营养价值，还会产生苦味、涩味等，极大的影响菜籽饼的口感。因此，在早期利用菜籽饼开发产品时，通常会通过有机溶剂浸提或微生物发酵等方式将多酚加以除去[3-4]。后来的研究表明菜籽多酚具有较强的还原能力，能清除自由基，提高生物体的免疫力[5-6]，对芝麻油和猪油在贮藏及油炸过程中有明显的抗氧化效果[7-8]，是一种极具开发价值的天然抗氧化剂。因此，对菜籽饼多酚进行分离、纯化，并加以利用，可以提高菜籽饼粕的综合利用价值。

菜籽饼中的酚类物质有3种存在形式：游离型的酚酸，可溶性酚，以及与蛋白质、糖等组成的不溶性化合物。其中游离态的酚酸最少，绝大多数酚类化合物以不溶解的结合状态存在，这给多酚的提取带来了困难。酚类物质的提取方法有很多，最常用的是溶剂提取，它不需要特殊的设备，操作简单易行，但同时也存在处理时间长、提取效率低等缺点。因此出现了一些辅助提取的方法，如酶、超声波、微波等辅助提取[9-10]。酶辅助提取技术通过酶反应将影响提取的杂质分解除去，加速有效成分的释放，具有快速、高效、反应条件温和、专一性强等诸多优点，已越来越广泛应用于动植物原料中有效成分的提取。本实验采用复合酶解（纤维素酶和蛋白酶）技术辅助乙醇溶剂法，从菜籽饼中提取多酚，以菜籽多酚的提取率为参考指标，探求酶法辅助乙醇提取多酚的最佳工艺条件，为菜籽饼茶多酚的提取和籽饼粕的综合利用提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料

菜籽饼购自自贡某菜籽油压榨厂，样品经50℃烘12 h左右后，磨细过40目筛备用。纤维素酶，酶活力为2万u/mg～15万u/mg，温度范围20℃～55℃，pH 4.0～6.5；酸性蛋白酶，酶活力为10万u/mg～40万u/mg，温度范围20℃～55℃，pH 3.0～5.5，2种酶均来自宁夏和氏璧生物技术有限公司，为食品级。

1.1.2 药品

乙醇、单宁酸标准品、醋酸、醋酸钠、钨酸钠、钼酸钠、浓磷酸、浓盐酸、硫酸锂、碳酸钠和石油醚（30℃～60℃沸程）等，均为分析纯。

1.1.3 试剂

醋酸-醋酸钠缓冲液，Folin-Ciocalteu显色试剂。1.1.4仪器

752 型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器公司；HHS-6型电热恒温水浴锅：上海衡平仪表仪器；AR1140型电子分析天平：奥豪斯国际贸易上海公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵：上海市东玺制冷仪器设备有限公司；LGJ0.2型冷冻干燥机：上海医用分析仪器；MZ10型中药粉碎机：青岛迈科隆粉体技术设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 总工艺流程

菜籽饼→干燥→粉碎、过40目筛→石油醚脱脂→酶解→乙醇提取→抽滤→冷冻干燥→多酚成品

1.2.1.1 酶解

取5 g菜籽饼样品于100 mL三角瓶中，加入一定量的纤维素酶和蛋白酶，再加入一定pH的醋酸-醋酸钠缓冲液18 mL，用保鲜膜封口，恒温水浴加热处理一段时间后，70℃水浴加热10 min使酶失活。

1.2.1.2 乙醇提取

参照汤务霞[11]的方法。取42 mL无水乙醇加入酶失活后的酶解液中（使得乙醇体积分数为70%、并且料液比为1∶12），用醋酸调节初始pH为3，用保鲜膜封口，水浴恒温52℃加热50 min，将浸提液减压抽滤。滤渣再用70%的乙醇溶液60 mL重复浸提1次。合并2次滤液，冷冻干燥制备多酚成品。

1.2.2 菜籽多酚含量的测定

用改良后的Folin-Ciocalteu法（相关数据已投稿、还未发表）测定菜籽多酚含量，以单宁酸作为标准物。

1.2.2.1 改良后的Folin-Ciocalteu法

吸取1 mL的待测样品，放入25 mL容量瓶内，加10 mL 70%乙醇，摇匀，加入2.5 mL的显色剂和4 mL的饱和Na2CO3溶液，并用70%乙醇定容至25 mL，在40℃下避光反应50 min后，以70%乙醇做空白对照，在757 nm波长下测定吸光值。

1.2.2.2 标准曲线的绘制

配制1.0mg/mL的单宁酸标准溶液，分别取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45和0.5 mL标样，按照改良后的Folin-Ciocalteu法进行显色反应，检测其吸光度A，以吸光值与加入的标样量作线性回归分析，得到回归方程为y=8.637 5x+0.004 9，x表示浓度（mg/L），y表示吸光度，相关系数R2为0.993 7。

1.2.2.3 菜籽饼多酚含量的测定

将分离得到的菜籽饼多酚干品用70%的乙醇溶液溶解、并定容至100 mL，确定其浓度在标准曲线线性范围内。再吸取1 mL移入25 mL容量瓶，按照改良后的Folin-Ciocalteu法进行显色反应，检测其吸光度A。根据公式计算提取率，公式如下：

菜籽饼多酚提取率/%=[（A-0.004 9）×100×25× 100]/8.637 5×1 000×5

1.3试验设计

1.3.1 双酶法预处理的研究

1.3.1.1 单因素试验

设计单因素试验，以多酚提取率为指标，研究纤维素酶添加量、蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间对菜籽饼多酚提取的影响。

纤维素酶添加量的选择：在初始pH 5.0，温度50℃，时间3 h，蛋白酶添加量0.5%的条件下，考察不同纤维素酶添加量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2.0%）对多酚提取率的影响。

蛋白酶添加量的选择：在初始pH 5.0，温度50℃，时间3 h，纤维素酶添加量1.6%的条件下，考察不同蛋白酶添加量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%和1.0%）对多酚提取率的影响。

初始pH的选择：在温度50℃，时间3 h，蛋白酶添加量0.7%，纤维素酶添加量1.6%的条件下，考察不同初始pH（4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8）对提取率的影响。

温度的选择：在初始pH 5.4，时间3 h，蛋白酶添加量为0.7%，纤维素酶添加量为1.6%的条件下，考察不同温度（30、35、40、45、50、55、60、65℃）对多酚提取率的影响。

时间的选择：在温度50℃、初始pH5.4，蛋白酶添加量0.7%，纤维素酶添加量1.6%的条件下，考察不同酶解时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 h）对多酚提取率的影响。

1.3.1.2 正交试验

根据单因素实验，选取对多酚提取率有主要影响的因素（纤维素酶添加量、蛋白酶添加量、温度、时间），设计四因素三水平L9（34）进行正交试验，优化酶解预处理的工艺参数。因素三水平L9（34）正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1Factors and levels of orthogonal test

1.3.1.3 工艺验证

根据正交实验中得出的最佳酶解工艺条件，设计3个平行实验，对其进行验证。

1.3.2 酶解法与非酶解法的比较

分别取非酶解处理的样品和经最佳酶解工艺处理过的样品各3个，采用汤务霞[11]的方法提取多酚，比较两种方法对菜籽多酚提取率的影响。

2 结果与分析

2.1 双酶法预处理

2.1.1 单因素实验结果与分析

2.1.1.1 纤维素酶添加量的选择

纤维素酶添加量对菜籽饼多酚提取的影响见图1。

图1 纤维素酶添加量对多酚提取率的影响Fig.1 The influence of cellulase adding on polyphenol extraction rate

当纤维素酶液浓度在0.6%～1.6%范围时，菜籽饼多酚提取率随酶添加量的增加而增加，当纤维素酶量为1.6%时，多酚提取率最高（为2.47%），之后虽然酶量继续增加了，但多酚提取率基本保持稳定，因此认为适宜的纤维素酶添加量为1.6%。纤维素酶可破坏植物的细胞壁与细胞间质，促使多酚等胞内物质快速扩散溶出，提高有效成分的提取率，但当酶解反应完全、多酚充分提取出来以后，继续增加酶量，对提取率的影响不大。另一方面，在较低的酶浓度下，酶与底物尚可较充分地结合；随着酶浓度的升高，底物浓度不能对酶达到饱和，导致酶的作用受到抑制，所以对一定的底物浓度均存在一个最佳酶用量，并非酶越多酶解效果就越好。

2.1.1.2 蛋白酶添加量的选择

蛋白酶添加量对菜籽饼多酚提取的影响见图2。

当蛋白酶液浓度在0.3%～0.8%范围时，菜籽饼多酚提取率随着酶添加量的增加而增加，当纤维素酶量为0.8%时，多酚提取率最高（为2.58%），之后，虽然酶量增加了，但多酚提取率基本保持不变，因此认为适宜的蛋白酶添加量为0.8%。蛋白酶可降解菜籽饼中的蛋白质，从而释放其所吸附的多酚，但当酶添加量达到一定程度之后，酶与底物的作用饱和，再加大酶量所产生的作用也很小。

图2 蛋白酶添加量对多酚提取率的影响Fig.2 The influence of protease adding on polyphenol extraction rate

2.1.1.3 初始pH的选择

初始pH对菜籽饼多酚提取的影响见图3。

图3 初始pH对多酚提取率的影响Fig.3 The influence of initial pH on polyphenol extraction rate

当初始pH在4.4～5.4范围时，菜籽饼多酚的提取率随pH增加而缓慢增加，当pH为5.4时，多酚提取率最高（为2.65%），之后，多酚提取率随着pH增加而下降，因此认为适宜的酶解pH为5.4。

2.1.1.4 温度的选择

温度对菜籽饼多酚提取的影响见图4。

图4 温度对多酚提取率的影响Fig.4 The influence of temprature on polyphenol extraction rate

当酶解温度在30℃～55℃范围时，菜籽饼多酚的提取率随温度增加而上升，当温度为55℃时，多酚提取率最高（为2.71%），之后，随着酶解温度的继续升高，多酚提取率反而下降，因此认为适宜的酶解温度为55℃。在未达到酶的最适作用温度前，升高温度增加了包括酶和底物分子在内的溶液体系的热能，既可使胞内活性物质分子运动速度加快，又能提供酶促反应所需的能量，使酶解破壁作用加强，故多酚提取率在开始阶段迅速提高。但温度继续升高会生物酶部分甚至全部变性，抑制酶促反应，导致多酚提取率下降。2.1.1.5时间的选择

时间对菜籽饼多酚提取的影响见图5。

图5 时间对多酚提取率的影响Fig.5 The influence of time on polyphenol extraction rate

当酶解时间在0.5 h～3.5 h时，菜籽饼多酚提取率随反应时间延长而增加，反应时间为3.5 h时，多酚提取率最高（为2.78%），之后，多酚提取不再随酶解时间延长升高，而是基本保持不变，因此认为适宜的酶解时间为3.5 h。一方面，随着酶解时间的延长，植物细胞壁及细胞间层的纤维素和蛋白质形成的阻挡层已被有效破解，多酚大多已从细胞内扩散到溶液中，细胞内外的多酚浓度已达到了一种动态平衡，延长提取时间对提高溶液中多酚浓度作用有限；另一方面，纤维素酶和蛋白酶的酶促反应产物在溶液中浓度的积累会对酶促反应造成抑制；此外，菜籽饼中的某些酚类、单宁及花色素本来就是纤维素酶或蛋白酶的天然抑制剂，随着酶解的进行，它们在溶液中的浓度增高也会抑制酶进一步地发挥作用。

2.1.2 正交试验结果与分析

正交试验结果见表2。

纤维素酶添加量、蛋白酶添加量、反应温度和反应时间对多酚提取率有不同程度的影响，由极差分析得出RC>RD>RA=RB，说明各因素对多酚提取率影响的大小次顺序为：反应温度>反应时间>蛋白酶添加量=纤维素酶添加量，最显著的影响因子为反应温度。最佳的酶预处理工艺参数为A1B2C2D1，即纤维素酶添加量为1.4%，蛋白酶添加量为0.7%，反应温度为50℃，反应时间为3 h。

2.1.3 最佳工艺的验证

验证性试验发现多酚提取率平均值为3.12%，均高于单因素实验和正交试验结果，表明此工艺具有一定的合理性。

2.2 酶解法与非酶解法提取多酚的比较

分别取非酶解处理的样品和经最佳酶解工艺处理过的样品各6个，采用汤务霞[11]的方法提取多酚。酶解法与非酶解法提取多酚的比较见图6。

表2 正交试验结果Table 2Results of orthogonal test

图6 酶解法对多酚提取的影响Fig.6 Effect of Enzymolysis on polyphenol extraction

非酶解处理的菜籽饼经乙醇浸提，大约50 min后多酚提取量率达到最大值，为2.02%；而经最佳酶解工艺处理过的菜籽饼经乙醇浸提，只需40 min即可获得最大提取率，为3.12%，研究结果说明较之非酶解法，双酶解法预处理可极大地提高菜籽饼多酚的提取率，提高了约54.46%。

3 小结

本实验用纤维素酶和蛋白酶对菜籽饼进行复合预处理，然后采用乙醇浸提法提取菜籽饼多酚，研究双酶法预处理对菜籽饼多酚提取率的影响。研究表明双酶法预处理的最佳工艺条件为：纤维素酶添加量1.4%，蛋白酶添加量0.7%，反应温度50℃，反应时间3h，酶解初始pH5.4，在此条件下多酚的得率为3.12%。研究还发现：较之非酶解法，双酶解法预处理可极大地提高菜籽饼多酚的提取率，提高了约54.46%。

酶解辅助乙醇浸提法从菜籽饼中提取多酚不仅具有高效温和、节能环保等优点，而且多酚提取率比单纯的乙醇浸提法高。本研究所建立的双酶法辅助乙醇浸提法为菜籽饼多酚的提取提供了一种新工艺，同时也为去除菜籽饼中的抗营养因子、提高菜籽饼的综合利用水平开辟了新途径。

[1]刘文冰.浅析我国油菜生产的现状与发展[J].中国种业,2005 (1):17-18

[2]陈刚,彭健,刘振利,等.中国菜籽饼粕品质特征及其影响因素研究[J].中国粮油学报,2006,21(6):95-99

[3]严奉伟,邓明,朱建飞.菜籽粕综合利用[J].粮食与油脂,2005, 12(9):6-8

[4]陈刚,彭健,刘振利,等.中国菜籽饼粕品质特征及其影响因素研究[J].中国粮油学报,2006,21(1):95－99

[5]严奉伟,罗祖友,薛照辉,等.菜籽多酚的抗氧化作用[J].中国油脂,2005,30(7):54-57

[6]严奉伟,王辰,严赞,等.菜籽多酚对S180小鼠肉瘤及其免疫功能的影响[J].中国粮油学报,22(5):81-84,97

[7]严奉伟,李霄燕,王辰.菜籽多酚在芝麻油贮藏与油炸过程中的抗氧化效果[J].食品工业,2008(6):18-19

[8]严奉伟,秦霞,高梦祥,等.菜籽多酚在猪油中的抗氧化作用[J].食品工业科技,2008,29(12):94-96,100

[9]NACZK M,SHAHIDI F.Extraction and analysis of phenolics in food [J].Journal of Chromatography A,2004,1054:91-111

[10]谢蓝华,肖南,张嘉怡,等.复合酶解辅助乙醇提取茶多酚工艺研究[J].茶叶科学2013,33(1):27-33

[11]汤务霞,张银,汤超,等.乙醇浸提菜籽饼中多酚的响应面优化及体外抗氧化性研究[J].中国食品,2012(2):126-131

The Effect of Double Enzymatic Pretreatment on Polyphenol Extraction from Rapeseed Cake

XIONG-Li，GU Liang-Fu
（Department of Biological Engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

In order to research the effect of enzymolysis on polyphenol extraction rate，polyphenol was extracted with ethanol after composite pretreatment of rapeseed cake with cellulase and protease.Results showed that the optimal condition of double enzymatic pretreatment was：cellulase add quantity 1.4%，proteinase 0.7%，reaction temperature 50℃，reaction time 3 h and initial pH5.4.On this condition，polyphenol extraction rate was 3.12%.Compared with non-enzymolysis，the double enzymolysis could increase polyphenol extraction rate by about 54.46%.

rapeseed cake；polyphenol；cellulase；protease；extract

2013-10-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.009

四川理工学院大学生创新基金（CX20130406）

熊俐（1976—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：食品科学。