响应面法优化热水浸提啤酒花多糖的工艺研究

张占军，葛洪，郑倩倩，陈慧，王春云

（扬州市职业大学生物与化工工程学院，江苏扬州225009）

响应面法优化热水浸提啤酒花多糖的工艺研究

张占军，葛洪，郑倩倩，陈慧，王春云

（扬州市职业大学生物与化工工程学院，江苏扬州225009）

研究筛选啤酒花多糖的热水浸提最佳提取工艺条件。以浸提温度、料液比、浸提时间及浸提次数作为影响因素，以啤酒花多糖提取率为评价指标。在单因素试验的基础上，通过四因素三水平Box-Behnken中心组合试验，建立多糖提取率的二次多项式回归方程，经响应面回归分析得到优化组合条件。啤酒花多糖提取最优条件最终确定为：提取温度91℃，液料比14 mL/g，提取时间104 min以及提取次数2次。在该条件下多糖提取率实验值与预测值间存在较好的一致性。所得二元多次回归方程是准确的且适用于对啤酒花中多糖的提取进行预测。

响应面法；啤酒花；多糖；提取

啤酒花（Humulus Lupulus L.）又名忽布（英语俗名Hop）、香蛇麻花、酒花、野酒花，桑科草属多年生攀援草本植物。它是一种较耐寒不耐热的植物，主要分布于我国西北地区、新疆北部、东北、华东及山东、甘肃、陕西等地[1]。啤酒花的主要用途是用于啤酒酿造，但随着近年来对啤酒花研究的深入，啤酒花中新的生物和药理活性成分不断被发现，已从中分离和鉴定出了400多种化合物这些化合物中的生物和药理活性成分结构与功能之间的关系也已逐渐被探明，而与其他研究相比，对啤酒花中的糖类物质的研究相对薄弱，已发表的相关性文献数量非常有限，有关其中所含糖类化合物的组成和结构信息的研究鲜见报道[2]。多糖广泛存在于植物、微生物（真菌和细菌）、藻类和动物体，目前多糖的研究已成为天然药物及食品研发的重要组成部分。响应面分析法（response surface methodology，RSM）是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法，广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等工艺条件方面的优化[3-7]。它与正交试验设计法不同，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点，并能够通过相应图寻求在整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。本工作拟在单因素试验的基础上，利用响应面分析法对啤酒花多糖（HLP）提取工艺条件进行优化，为进一步开发和利用啤酒花提供实验和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒花：由新疆龙润啤酒花有限公司提供；石油醚（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；乙醇（分析纯），上海苏懿化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备（只标注主要的）

DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；5804R型高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；754型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；Alpha 1-2型冷冻干燥机：英国LABCONCO公司。

1.3 提取工艺流程

啤酒花→80℃烘干至恒重→粉碎（孔筛0.5 mm）→石油醚回流脱脂（液料比3，时间3 h）→55℃烘干→80%乙醇回流→65℃烘干→粉碎→加水搅拌浸提→离心（5 000 r/min，10 min）→上清液浓缩→加乙醇至75%终浓度→静止过夜→抽滤→滤渣→冷冻干燥

1.4 测定方法

1.4.1 啤酒花多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[8]。

1.4.2 葡萄糖标准曲线的制作

取经105℃干燥恒重的葡萄糖500 mg，稀释定容至100 mL，从中取出1 mL溶液加蒸馏水定容至50 mL，此时葡萄糖浓度为0.1 mg/mL,精密吸取以上浓度的葡萄糖标准液各0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL，分别置于20 mL的比色管中，再依次加入蒸馏水使终体积为2 mL，同时吸取2 mL蒸馏水于比色管中作空白对照，然后在以上各管中加入5%苯酚1 mL，摇匀后立即加入5 mL浓硫酸，振荡，室温放置20 min后，用分光光度计在490.0 nm处测定其吸光值。

1.4.3 啤酒花多糖得率的计算

取干燥啤酒花多糖10 mg，定容至100 mL，吸取样品液1.0 mL，加入1 mL蒸馏水，按1.4.2操作，测光密度。

多糖得率Y（%）=（WE×CT）/WP×100

式中：WE为的粗提取物的重量，g；WP为每次实验中使用的预处理样品重量，g；CT为粗提取物中总糖的含量，%。

1.5 单因素实验

应用水提醇沉法提取啤酒花多糖，分别考察浸提温度、料液比、浸提时间及浸提次数对啤酒花多糖得率的影响。

1.6 响应面优化实验

基于单因素实验确定的各变量范围，利用Design-Expert软件（version7.1.1，Stat-Ease Corporation, USA）进行四因素三水平Box-Behnken实验设计，各因素的实验水平及编码列于表1。

表1 啤酒花多糖提取响应面分析因素水平表Table 1Factors and levels of Box-Benhnken design test on HLP extraction conditions

以提取温度、液料比、提取时间、提取次数为自变量，啤酒花粗多糖的提取率为响应值。表2列出Box-Behnken实验设计模型及其响应值，整个实验共计31组，其中中心点实验重复7组。每组实验重复3次，结果以均值±标准差表示。

表2 Box-Behnken实验设计模型及其响应值Table 2Box-Behnken design matrix and the response values for the yield of HLP

续表2 Box-Behnken实验设计模型及其响应值Continue table 2Box-Behnken design matrix and the response values for the yield of HLP

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线（苯酚-硫酸法）Fig.1 The standard curve of glucose determined by phenolsulfuric acid

2.2 啤酒花多糖单因素实验提取工艺条件的选择

2.2.1 浸提温度对啤酒花多糖得率的影响

准确称取啤酒花干品5.0 g，按料液比1∶12浸泡后，在60、70、80、90、100℃5个不同温度下，通过恒温磁力搅拌器浸提90 min，浸提1次后测定多糖含量，结果见图2。

图2 浸提温度对啤酒花多糖得率的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on Yield of HLP

由图2可知，不同提取温度对啤酒花多糖得率有较大影响，温度过低，不利于多糖物质的溶出；温度过高，容易引起多糖降解。在一定提取范围内，啤酒花多糖得率随着浸提温度的升高而增大，得率达到最大值，但超过一定范围后，随着温度的上升，多糖反而有下降的趋势，综合考虑，选择浸提温度为90℃为最佳浸提温度。

2.2.2 料液比对啤酒花多糖得率的影响

取经预处理的啤酒花粉碎干品5.0 g，在提取温度90℃条件下，以1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20 5个不同的料液比进行实验，平行实验3次，确定料液比对多糖得率的影响，结果如图3所示。

图3 液料比对啤酒花多糖得率的影响Fig.3 Effects of ratio of water to material on Yield of HLP

由图3可知，料液比较小和较大时，多糖得率都有一些偏低，较小时可能是因为溶剂量少使得物料变得粘稠，从而影响了多糖得率；较大时可能是因为溶剂量大给浓缩带来不便，从而导致多糖得率降低。因此，综合考虑，选择料液比1∶12为最佳料液比。

2.2.3 浸提时间对啤酒花多糖得率的影响

取经预处理的啤酒花粉碎干品5.0 g，在浸提温度90℃，以1∶12的料液比，在30、60、90、120、150 min 5个不同的时间条件下，确定浸提时间对多糖得率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，随着提取时间的延长，啤酒花多糖得率先逐渐增大，再逐渐降低，这可能是随着时间的延长，加快了细胞的破裂，从而使啤酒花多糖更好的溶解到水中，多糖得率增大。但时间超过90 min之后，得率增加不明显，而且时间的延长可能使啤酒花多糖的结构发生变化，同时综合成本考虑，提取时间在90 min左右为宜。

2.2.4 提取次数对啤酒花多糖得率的影响

准确称取啤酒花粉碎干品5.0 g，在90℃浸提温度下，以1∶10的料液比进行实验，通过恒温磁力搅拌器浸提90 min，分别浸提1、2、3、4、5次后计算多糖含量，结果见图5。

图4 浸提时间对啤酒花多糖得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on Yield of HLP

图5 提取次数对啤酒花多糖得率的影响Fig.5 Effects of extraction times on Yield of HLP

由图5可知，提取次数的增多能提高啤酒花多糖的得率，但提取3次后，残渣中多糖含量明显降低，再增加提取次数已无实际意义，故从节省能耗、减少操作工序以及经济性考虑，优化时提取次数的考察水平分别取1次，2次及3次为宜。

2.3 响应面法优化啤酒花多糖提取工艺的选择

2.3.1 模型的建立及显著性检验

利用Design-Expert软件对试验数据进行回归分析，得到以下二元多次回归方程：

Y=2.551 4+0.105 8X1+0.150 0X2+0.114 2X3+ 0.061 6X4-0.007 5X1X2-0.050 0X1X3-0.030 0X1X4+ 0.092 5X2X3-0.035 0X2X4-0.035 0X3X4-0.251 9X1X1-0.210 7X2X2-0.151 9X3X3+0.048 2X4X4

其中Y表示提取物中多糖的含量，X1、X2、X3、X4分别是被测变量提取温度、液料比、提取时间、浸提次数的编码值。

利用Design-Expert软件对上述多元回归模型进行方差分析（ANOVA）及统计显著性和适合度检验，结果列于表3。

表3 多元回归模型方差分析表Table 3Analysis of variance（ANOVA）for the Response Surface Quadratic Model

从表2可以看出，F-检验显示回归模型有较高的F值（F=9.1）和极低的P值（P＜0.000 1），表明本回归模型是显著的，变异系数（Coefficient of variation）是衡量各观测值变异程度的一个统计量，本模型值为4.64，也表明该模型具有较高的精确性和良好的实验值可靠性[9]。决定系数（R2）反映出回归模型的适合度，R2值越接近于1，则实验值与预测值的相关性越好[10]。本结果决定系数R2值等于0.888 6，表明啤酒花多糖得率的实验值与预测值间有较好的一致性；调整决定系数adj-R2等于0.791 0，说明啤酒花多糖得率总变异中约79.10%是由独立变量决定的。此外，失拟度（Lack of Fit）是衡量模型在实验范围内不能代表的数据，不包括在模型中不能通过随机误差所解释的回归或者变化的数据[11]。本研究中，失拟度的F-值为4.04，p-值为0.050 6，失拟度相对于纯误差（pure error）是不显著的，失拟度的不显著使得回归模型具有更高的适合度。预测残差平方和（PRESS）为0.94，说明模型解释变差的能力较强，总体拟合具有统计显著性[12]。

2.3.2 等高线图和响应曲面图分析

响应曲面图（三维）和等高线图（二维）是运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来了解各个变量实验值与响应值之间的关系以及两个被测变量间交互作用的类型，从而选择试验设计中的最优化条件。等高线图的形状（圆形或椭圆形）反应了两被测变量间交互作用显著与否，椭圆形等高线表明两被测变量间交互作用是显著的，圆形等高线则意味着两被测变量间交互作用不显著，可以忽略不计[13]。

三维响应面和二维等高线图是回归方程的图形表示，本研究通过Design-Expert 7.1.1软件模拟生成，如图6及图7所示。

图6 各因素交互作用对啤酒花多糖得率影响的响应曲面图Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of four extraction parameters on the extraction yield of polysaccharides

利用Design-Expert软件，啤酒花多糖提取最优条件最终确定为：提取温度91.4℃，液料比13.7 mL/g，提取时间103.5 min以及提取次数2.3次。在此条件下，啤酒花多糖得率预测值为2.63%。考虑到操作的方便性，最优提取参数修正为提取温度91℃，水料比14 mL/g，提取时间104 min以及提取次数2次。

3 结论

在单因素试验设计的基础上，对啤酒花多糖提取工艺条件进行了四因素三水平的响应面法设计，从而建立了响应值和各因素之间的数学模型。结果表明，提取温度、液料比、提取时间的一次项及其二次项对啤酒花多糖得率的影响显著，而它们的交互项作用不明显。

利用Design-Expert软件，啤酒花多糖提取最优条件最终确定为：提取温度91℃，水料比14 mL/g，提取时间104 min以及提取次数2次。在此条件下进行实验，结果表明实验值与预测值间存在较好的一致性，说明本研究所得二元多次回归方程是准确的且适用于对啤酒花中提取多糖进行预测。

图7 各因素交互作用对啤酒花多糖得率影响的等高线图Fig.7 Contour plot showing the interactive effects of four extraction parameters on the extraction yield of polysaccharides

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Optimization of Hot Water Extraction of Polysaccharides from Humulus Lupulus L. by Response Surface Methodology

ZHANG Zhan-jun，GE Hong，ZHENG Qian-qian，CHEN Hui，WANG Chun-yun
（College of biological and chemical engineering，Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，Jiangsu，China）

To optimize technology of hot water extract polysaccharides from Humulus Lupulus L.by response surface analysis.On the basis of single-factor experiments，the relationship between main extraction conditions including extraction temperature，ratio of water to material，extration time and extration times were modeled using a 4-factor，3-level Box-Behnken experimental design and studied the yield of polysaccharides.And then，the established model was analyzed by response surface methodology to obtain the optimum extraction conditions.The optimum extraction conditions were obtained as follows：extraction temperature，91℃；ratio of water to raw material，14 mL/g；extraction time，104 min；and extraction times，2.Under these conditions，the experimental value was well matched with value predicted by the model.The binary multiple regression equation is accurate and suitable for the extraction of polysaccharide from Humulus Lupulus L.

response surface methodology；Humulus Lupulus L.；polysaccharides；extraction technology

2013-07-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.008

江苏省基础研究计划（自然科学基金）项目（BK20141269）；江苏省高校大学生实践创新项目（2012JSSPITP4010）；江苏省高校“青蓝工程”资助（苏教师[2012]39号）

张占军（1977—），男（汉），副教授，博士研究生，研究方向：食品生物技术。