南极红色素与3种天然色素还原性和抗氧化性对比研究

赵倩，王能飞，张梅，金滨滨，吴佐浩，臧家业，*

（1.成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地四川成都611137；2.国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛266061）

南极红色素与3种天然色素还原性和抗氧化性对比研究

赵倩1，王能飞2，张梅1，金滨滨1，吴佐浩2，臧家业2，*

（1.成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地四川成都611137；2.国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛266061）

探讨南极红色素、胭脂虫红色素、紫甘蓝色素、紫苏色素的还原性和抗氧化性。结果表明，4种天然色素都具有一定程度的还原性和抗氧化性。浓度为1 mg/mL时，超氧阴离子清除率分别为26.52%、20.51%、15.32%、30.65%；DPPH自由基清除率分别为73.11%、16.23%、94.64%、96.92%；羟基自由基清除率分别为67.31%、42.03%、72.67%、58.37%。具有还原性和抗氧化性的天然色素，特别是真菌色素南极红色素，会有广阔的应用前景。

天然色素；南极红色素；还原性；抗氧化性

鉴于合成色素的危害性，特别是其致癌作用[1]，消费者对使用合成色素的食品抵触心理日益高涨。人们更倾向选择那些使用天然色素的食品，因为天然色素本身就来源于可食用资源，不仅没有毒性，有的还有一定的营养价值，甚至有的还有一定的保健功能。例如，类胡萝卜素有抗癌作用和提高机体免疫能力[2]；黄酮类化合物有抗氧化、抗衰老等作用[3]。因此天然色素越来越受食品加工厂商的青睐。

胭脂虫红色素（也称洋红酸）是一种提取自雌性胭脂虫的红色色素，也是一种品质优良的纯天然、无毒副作用的动物色素。但是，由于其原料胭脂虫的饲养受到食物、季节、天气、温度的影响较大，国内还没有胭脂虫和胭脂虫红的生产，胭脂虫红色素一直依赖进口，产品供不应求[4]。紫苏色素和紫甘蓝色素分别是提取自紫苏和紫甘蓝的一种紫红色色素，均可用于腌菜、果汁、饮料、糖浆等着色。Ilhami Gulcin[5]等研究了紫苏提取物的抗氧化能力和清除自由基能力。张会象[6]研究发现紫甘蓝色素具有一定的抑菌性和抗氧化性。本实验室自南极土壤样品中分离纯化得到一株产色素真菌Geomyces WNF-15A，通过菌落特征、显微形态观察和ITS序列分析，将其归为地丝霉属（Geomyces）[7]。前期研究表明，真菌Geomyces WNF-15A所产色素（取名南极红色素）为一种红色粉末，最佳吸收波长为531 nm，色价可达到140，另外，在稳定性方面不逊于以广泛使用的胭脂虫红色素。

本试验研究了南极红色素、胭脂虫红色素、紫甘蓝色素、紫苏色素的还原性和抗氧化性，并对以上性能与VC进行了对比，旨在评价4种色素的生理活性功能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

紫甘蓝色素、紫苏色素：购于青岛鹏远天然色素研究所；胭脂虫红色素：购于成都格雷西亚化学试剂有限公司；南极红色素：实验室自制；VC：购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 试剂

邻苯三酚，Tris（三羟甲基氨基甲烷）；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基），无水乙醇；水杨酸，硫酸亚铁，过氧化氢；磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，六氰合铁酸钾，三氯化铁，三氯乙酸。以上试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

HZQ－F160A全温摇床：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；通用型冷冻离心机：德国sigma公司；GI54DS自动高压蒸汽灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；UV2550紫外可见分光光度计：岛津公司；德国CHRIST Alpha 1-2冻干机：上海基汇生物科技有限公司、AL-104电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 南极红色素的制备

用无菌水洗刮Geomyces WNF-15A单菌落，转入马铃薯培养基中，培养3 d～4 d，作为真菌种子液。将真菌种子液接入发酵罐中，发酵，转速125 r/min，12℃培养10 d。将发酵液以7 000 r/min离心20 min，上清液4层纱布过滤。滤液用HPD-722型大孔吸附树脂浸泡，静置24 h。将大孔树脂装柱，用去离子水洗至洗脱液为无色，改用95%乙醇洗脱至无色，再用去离子水洗至无醇味，收集洗脱液。将洗脱液浓缩，冷冻干燥处理，得到南极红色素粗粉。

1.3 方法

1.3.1 清除超氧阴离子自由基能力的测定[8]

取不同浓度的南极红色素样品溶液0.1 mL，加入3 mL pH=8.2 Tris-HCl缓冲液，25℃环境保温20 min，加入0.3 mL 7 mmol/L的邻苯三酚，准确反应4min后加入1 mL 10 mol/L HCl终止反应。蒸馏水调零，测定吸光值A420，按下式计算清除率。

式中：A0为空白对照液的吸光度，以蒸馏水代替样品液；A1为样品组吸光度；A2色素溶液本身的吸光度，以蒸馏水代替反应试剂。

紫甘蓝色素、紫苏色素、胭脂虫红色素、VC清除超氧阴离子自由基能力的测定方法同前。

1.3.2 清除DPPH自由基能力的测定[9]

取不同浓度的南极红色素样品溶液0.5 mL，加入0.2 mol/L DPPH无水乙醇溶液2 mL，用无水乙醇补足反应总体积4 mL，混匀，40℃恒温避光静置30 min。无水乙醇调零，测定吸光值A517，按下式计算清除率。

式中：A0为空白对照液的吸光度，以蒸馏水代替样品液；A1为样品组吸光度；A2色素溶液本身的吸光度，以蒸馏水代替反应试剂。

紫甘蓝色素、紫苏色素、胭脂虫红色素、VC清除DPPH自由基能力的测定方法同前。

1.3.3 清除羟基自由基能力的测定[10]

取不同浓度的南极红色素样品溶液2 mL，加入9 mmol/L FeSO41mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL，混匀，加入8.8 mmol/L H2O2启动反应，室温下反应1 h。蒸馏水调零，测定吸光值A510，按下式计算清除率。

式中：A0为空白对照液的吸光度，以蒸馏水代替样品液；A1为样品组吸光度；A2色素溶液本身的吸光度，以蒸馏水代替反应试剂。

紫甘蓝色素、紫苏色素、胭脂虫红色素、VC清除羟基自由基能力的测定方法同前。

1.3.4 还原能力的测定[11]

取不同浓度的南极红色素样品溶液0.5 mL，加入0.2 mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液和1%的K3Fe（CN）6溶液各2.5mL，混匀，混合液50℃水浴20min，快速冷却，加入2.5mL10%的三氯乙酸溶液，混匀后以3000r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%的FeCl3，混匀，反应10 min。蒸馏水调零，测定吸光值A700。

紫甘蓝色素、紫苏色素、胭脂虫红色素、VC还原能力的测定方法同前。

2 结果与分析

2.1 清除超氧阴离子自由基能力的测定

自然条件下人体内存在一定数量的超氧阴离子自由基，在不发生化学变化的条件下对人体无害，但与羟基结合后的产物会导致细胞DNA损坏，破坏人类机体功能。因此，清除自由基能力是考察抗氧化剂的一个重要参考。清除超氧阴离子自由基能力如图1所示。

图14 种色素清除超氧阴离子自由基能力的比较Fig.1 The comparison of inhibitory effect of the four pigments on Superoxide anion radicals

由图1可看出，虽然4种试验色素清除超氧阴离子自由基的能力都随色素浓度的增大而增加，但4种色素清除超氧阴离子自由基能力还是有较大的差距。由图知，清除能力VC>紫苏色素>南极红色素>胭脂虫红色素>紫甘蓝色素。

2.2 清除DPPH自由基能力的测定

DPPH自由基有单电子，在517 nm处有一强吸收峰，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使吸收逐渐消失，褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。

清除DPPH自由基能力如图2所示。

图24 种色素清除DPPH自由基能力的比较Fig.2 The comparison of DPPH free radical-scavenging activity of the four pigments

由图2可看出4种试验色素都具有清除DPPH自由基的能力，并且随着色素浓度的增大而增加。清除能力大小依次为VC>紫甘蓝色素>紫苏色素>南极红色素>胭脂虫红色素。同等浓度的南极红色素的清除DPPH自由基能力远大于胭脂虫红色素，是南极红色素对胭脂虫红色素的一个明显优势。

2.3 清除羟基自由基能力的测定

清除羟基自由基能力测定结果如图3所示。

图3 4种色素清除羟基自由基能力的比较Fig.3 The comparison of inhibitory effect of the four pigments on Hydroxyl radicals

由图3看出VC是一种清除羟基自由基很显著的物质，在浓度为0.5 g/L时，其清除羟基自由基能力就可以达到90%以上，是同浓度其它色素的2倍，甚至3倍。南极红色素的清除羟基自由基的能力亦优于胭脂虫红色素。

2.4 还原能力的测定

还原性测定结果如图4所示。

图4 4种色素还原能力的比较Fig.4 The comparison of reducing capacity of the four pigments

由图4可看出各种色素的还原性都随浓度的增大而增加，但都小于同等浓度的VC。当色素浓度达到1g/L时，还原性大小依次为VC>紫甘蓝色素>紫苏色素>南极红色素>胭脂虫红色素。在色素浓度低于0.3 g/L时，还原性大小依次为VC>南极红色素>紫甘蓝色素>紫苏色素>胭脂虫红色素。在色素浓度较低时，南极红色素的还原性优势明显。

3 讨论

通过试验，发现4种天然色素都具有一定的还原性及清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的能力。综合比较不难看出，紫甘蓝色素活性会排在第一位，南极红色素活性和紫苏色素活性相当，而胭脂虫红色素活性最低。在试验过程中我们也发现了不足之处，4种天然色素的各项测试指标均低于同等条件下的VC测定值。一个原因是试验中使用的天然色素提取物的纯度不足。笔者认为，提高天然色素的纯度或者增加天然色素的使用浓度可弥补此方面的不足。

就南极红色素而言，在浓度为1 mg/mL时，南极红色素对DPPH自由基清除率可达到73.1%、对超氧阴离子自由基清除率为26.5%、对羟基自由基清除率达到67.3%。这些数据都充分说明了南极红色素具有抗氧化的生理活性功能，为南极红色素的推广和应用提供了有利的理论支持。南极红色素是本实验室自南极土壤样品中纯化得到的真菌所分泌的色素。经处理后，每升发酵液可以获得1.7 g紫红色色素干品粗粉[12]，在同类产色素真菌中具有相当明显的优势。前期的实验研究表明，南极红色素的稳定性、溶解性等方面都有明显的优势。本实验室正在对南极红色素进行纯化，探明其主要成分，提高纯度。南极红色素是一种真菌色素，利用真菌生产色素有其独到的优势，例如，真菌易于培养、不受季节限制；生产工艺简单、周期较短；成本较低等。单纯从植物（例如，紫甘蓝和紫苏）或者动物（胭脂虫）获得天然色素已经不能满足高速发展的食品行业，利用真菌生产色素会逐渐成为一种趋势。

[1]海因里希·左林格．色素化学:有机染料和颜料的合成、性能和应用[M]．吴祖望,译.北京:化学工业出版社,2005

[2]Armstrong G A,Hearst J E.Carotenoids 2:Genetics and molecular biology of carotenoid pigment biosynthesis[J].The FASEB Journal, 1996,10(2):228-237

[3]裴凌鹏,惠伯棣,金宗濂,等.黄酮类化合物的生理活性及其制备技术研究进展[J]．食品科学,2004(2):203-207

[4]王文亮,王守经,孙守义,等.胭脂虫资源的开发与利用研究[J].农产品加工,2008,5:22-26

[5]Ilhami Gulcin,Dali Berashvili,Akcahan Gepdiremen.Antiradical and antioxidant activity of total anthocyanins from Perilla pankinensis decne[J].Journal of Ethnopharmacology,2005(101):287-293

[6]王倩,汪云,宦卫青,等.紫甘蓝色素的抑菌性和抗氧化性研究[J].天然产物研究与开发,2010(22):1057-1060

[7]王风芹,许宾,孙云飞,等.一株南极真菌的鉴定及其分泌的色素性质分析[J].食品学报,2013(3):189-195

[8]RUCH R J.Prevention of oytotoxicity and inhibition of intercellular communication by antioxidant catechinisisolated from Chinese green tea[J].Carcinogenesis,1989(10):1003

[9]贾东英,姚开,何强,等.柚皮提取物不同级分的抗氧化活性研究[J].四川大学学报:工程科学版,2004,36(6):48-50

[10]赵永芳.生物化学技术原理及其应用[M].2版.武汉:武汉大学出版社,1994

[11]刘杰超,王思新,焦中高,等.苹果多酚提取物抗氧化活性的体外试验[J].果树学报,2005,22(2):19-21

[12]孙云飞,臧家业,张波涛,等.南极真菌Geomyces sp．产色素条件及色素提取的研究[J].海洋科学进展,2011,A1:116-121

The Comparison of Reducing Capacity and Antioxidant Activity of Three Natural Pigments from Antarctic Red Pigment

ZHAO Qian1，WANG Neng-fei2，ZHANG Mei1，JIN Bin-bin1，WU Zuo-hao2，ZANG Jia-ye2，*
（1.School of Pharmacy.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine（TCM），Key Laboratory of Chinese Herbal Medicines of Ministry of Education，State Key Laboratory Breeding Base of Systematic research，development and Utilization of Chinese Medicine Resources，Chengdu 611137，Sichuan，China；2.The First Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061，Shandong，China）

The aim of this work was to study the reducing power and antioxidant activity of four natural pigments，which were Antarctic red pigment，cochineal pigment，purple cabbage，folium perilliae.The resultsshowed that they had reducing capacity and antioxidant activity.When the content was 1mg/mL，the maximum scavenging rates on superoxide anion radicals were 26.52%，20.51%，15.32%，30.65%，the maximum scavenging rates on DPPH were 73.11%，16.23%，94.64%，96.92%，the maximum scavenging rates on hydroxyl radicals were 67.31%，42.03%，72.67%，58.37%.Therefore，the nature pigments with antioxidant activity and reducing capacity，especially the fungi pigments Antarctic red pigment，will have broad prospects in application.

Nature pigments；Antarctic red pigment；Reducing Capacity；Antioxidant Activity

2013-08-28

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.029

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金南极紫红色素的开发及提取工艺研究；南北极环境综合考察与评估专项站基生物生态环境本底考察（CHINARE 2014-02-01）；南北极环境综合考察与评估专项生物生态环境本底考察（CHINARE 2014-04-01）资助

赵倩（1987—），女（汉），硕士研究生，长期从事天然产物与天然色素研究。