猴腿蹄盖蕨总黄酮的超声提取工艺

王晓林，钟方丽，徐静，李艳秋

（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022）

猴腿蹄盖蕨总黄酮的超声提取工艺

王晓林，钟方丽*，徐静，李艳秋

（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022）

以提取得率为考察指标，通过单因素和正交试验探索了猴腿蹄盖蕨总黄酮的超声提取工艺条件。猴腿蹄盖蕨总黄酮最佳的超声提取条件为：料液比为1∶45（g/mL），乙醇浓度为60%，提取时间为105 min，提取次数为3次，在此条件下，猴腿蹄盖蕨总黄酮的提取率为162.71 mg/g，说明超声法可用于猴腿蹄盖蕨总黄酮的提取，具有一定的应用价值。

猴腿蹄盖蕨；总黄酮；提取

猴腿蹄盖蕨，俗称猴腿，是一种山野菜，氨基酸含量丰富，属于蹄盖蕨科植物，广泛分布于吉林省长白山地区[1]。猴腿蹄盖蕨既可食用，又可药用，是珍贵的药食两用山野菜，味甘、微苦、涩凉，具有安神、降压、利尿、解热镇痛、驱风湿、驱虫、止血、治蛇虫叮咬等功效，猴腿蹄盖蕨既可在山上采摘，也可以进行人工栽植，发展前景非常广阔[2-4]。猴腿蹄盖蕨主要含有黄酮、有机酸、蜕皮甾酮、萜类等多种活性物质，其中黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒等多种活性。超声波提取是利用超声波空化作用加速植物有效成分浸出的提取，具有设备简单、操作方便、提取时间短、产率高、无需加热，有利于保护热不稳定成分、省时、节能、提取率高等优点，已广泛应用于玫瑰花、甘木通、广金钱草等植物总黄酮的提取[5-8]。目前关于蕨类植物黄酮类成分的提取、纯化、含量测定的研究已有公开报道[9-11]，而猴腿蹄盖蕨总黄酮超声提取工艺的研究尚未见报道，本课题采用超声波法对猴腿蹄盖蕨黄酮类成分进行了提取工艺的研究，从而为更有效地开发猴腿蹄盖蕨提供了参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

MAS-Ⅱ型超声波提取仪：济宁金百特电子有限公司；752N型紫外可见分光光度计、JY2002型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；W5-100SP型恒温水浴锅：上海申生科技有限公司；CS101-AB型电热鼓风干燥箱：中国重庆实验设备厂；RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D型循环水真空泵：河南省巩义市英峪仪器一厂；芦丁对照品：中国药品生物制品检定所；猴腿蹄盖蕨采自吉林市蛟河地区，经吉林化工学院药学系薛健飞博士鉴定为蹄盖蕨科植物猴腿蹄盖蕨；水为重蒸馏水；硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、无水乙醇均为分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 检测波长的选择

精密称取干燥至恒重的芦丁对照品20.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入60%乙醇适量，超声使其溶解，用60%乙醇定容，配制成浓度0.20 mg/mL的芦丁对照品溶液。称取干燥的猴腿蹄盖蕨5 g，加入6倍量60%乙醇提取3次，每次2 h，合并滤液并定容于100 mL容量瓶中，即得供试品溶液。精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液各1.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂做空白，在波长240 nm～700 nm范围内进行扫描，供试品、对照品溶液在508 nm均出现吸收峰，所以选择508 nm为检测波长。

1.2.2 标准曲线的制备

精密吸取上述芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，按1.2.1项下的方法，在508 nm波长处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，进行直线回归，绘制标准曲线[12-13]，回归方程为A=11.969C-0.001 25，R=0.999 9，结果表明芦丁在0.0～0.048 mg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

1.2.3 样品含量测定

精密吸取提取液适量，以相应试剂为空白，照1.2.1项下的方法，于508 nm处测定吸光度，通过回归方程计算出提取液中总黄酮的浓度，进而计算出提取液中总黄酮的质量和总黄酮提取率，计算公式如下：

总黄酮提取率（mg/g）=提取液中总黄酮的质量（mg）/猴腿蹄盖蕨的质量（g）

1.2.4 猴腿蹄盖蕨总黄酮的超声提取实验

取猴腿蹄盖蕨粉末2.5 g，置250 mL圆底烧瓶中，按规定加入不同体积不同浓度的乙醇水溶液，放入超声机中并在设定温度下按规定时间超声提取，过滤，合并提取液，精密吸取上述提取液适量，按1.2.1项下方法测定提取液总黄酮含量，计算总黄酮提取率。以猴腿蹄盖蕨总黄酮提取率为指标，分别考察料液比、提取时间、提取次数、乙醇浓度等因素对猴腿蹄盖蕨总黄酮提取率的影响。在上述单因素试验的基础上，以总黄酮提取率为考察指标，固定提取次数为3次，选择料液比（1∶40、1∶45、1∶50）、提取时间（75、90、105 min）、乙醇浓度（55%、60%、65%）作为考察因素，按三因素三水平进行正交试验。

2 结果与分析

2.1 料液比对总黄酮提取率的影响

称取猴腿蹄盖蕨粉末2.5 g，设定料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL），加入浓度为45%的乙醇，超声提取2次（每次60 min），过滤，合并提取液，按1.2.1项下方法测定提取液中总黄酮的含量，计算出总黄酮提取率，结果见图1。

图1 料液比对提取效果的影响Fig.1 Effect of the ratio between raw material and solvent on extracting efficiency

由实验数据可知总黄酮提取率开始随溶剂量的增加而增加，在料液比达到1∶40 g/mL时，总黄酮的提取率已达到较高水平，在料液比达到1∶50时，提取率最高，再增加料液比，总黄酮提取率略有下降为了进一步考察料液比对猴腿蹄盖蕨总黄酮提取率的影响，选择料液比分别为1∶40、1∶45、1∶50进行正交试验。2.2超声提取时间对提取率的影响

称取猴腿蹄盖蕨粉末2.5g，料液比为1∶50（g/mL），加入浓度为45%的乙醇，超声提取2次，每次分别提取30、60、90、120、150 min，过滤，合并提取液，按1.2.1项下方法测定提取液中总黄酮的含量，计算出总黄酮提取率，结果见图2。

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 Effect of the extraction time on extracting efficiency

通过实验结果可知提取率随提取时间的延长有所增加，在提取时间达到90 min时，提取率最高，之后提取率随提取时间的延长反而有所下降，分析原因可能是随着提取时间的延长，导致部分黄酮类化合物受到破坏所致。为了进一步考察提取时间对提取率的影响，分别选择提取时间为75、90、105 min进行正交试验。

2.3 超声提取次数对提取效果的影响

称取2.5g猴腿蹄盖蕨粉末，料液比为1∶50（g/mL），加入浓度为45%的乙醇，超声提取1、2、3、4、5次，每次90 min，分别过滤，滤液按1.2.1项下方法测定总黄酮的含量，计算总黄酮提取率，结果见图3。

图3 提取次数对提取效果的影响Fig.3 Effect of the extraction times on extracting efficiency

由实验结果可知，提取3次后总黄酮提取率达到总提取率的96.6%，所以固定超声次数为3次。

2.4 乙醇浓度对提取效果的影响

称取2.5g猴腿蹄盖蕨粉末，料液比为1∶50（g/mL），分别加入浓度分别为30%、45%、60%、75%、90%的乙醇溶液，超声提取3次，每次90 min，合并提取液，滤液按1.2.1项下方法测定总黄酮的含量，计算总黄酮提取率，结果见图4。

图4 乙醇浓度对提取率的影响Fig.4 Effect of the concentration of ethanol on extracting efficiency

实验数据表明提取率开始随着乙醇浓度的升高而提高，在乙醇浓度为60%时总黄酮提取率达到最高值，之后随乙醇浓度的增加提取率明显下降。为了进一步考察乙醇浓度对提取率的影响，选择乙醇浓度分别为55%、60%、65%进行正交试验。

2.5 正交试验

2.5.1 因素及水平的确定

正交试验的因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1The table of factors and levels

2.5.2 正交试验

称取2.5 g猴腿蹄盖蕨粉末，按L9（33）正交试验表进行实验，按1.2.1项下方法测定提取液的吸光度，计算总黄酮提取率，确定超声提取猴腿蹄盖蕨总黄酮的最佳工艺，结果见表2。

由正交试验数据可知猴腿蹄盖蕨总黄酮的最佳提取工艺条件为A2B3C2，即料液比1∶45（g/mL）、乙醇浓度60%、提取3次、每次超声105 min。由于提取时间处于第3水平，所以在进行A2B3C2组合实验时，同时又进行了A2B4C2（超声120 min）组合实验，对上述两组实验结果进行比较可知：A2B3C2组合的总黄酮提取率为160.78 mg/g，A2B4C2组合的总黄酮提取率为153.97 mg/g，所以选择A2B3C2组合、提取3次为猴腿蹄盖蕨总黄酮的最佳提取工艺。

2.6 超声提取的工艺验证性实验

称取2.5 g猴腿蹄盖蕨粉末，加入浓度为60%的乙醇，料液比为1∶45（g/mL），提取3次，每次105 min，合并提取液，滤液按1.2.1项下方法测定总黄酮的含量，计算总黄酮提取率。为了考察上述提取工艺的稳定性，按此工艺条件提取3次，结果猴腿蹄盖蕨总黄酮提取率分别为162.92、161.47、163.75 mg/g，平均为162.71 mg/g，说明经过单因素和正交实验优选出的猴腿蹄盖蕨总黄酮超声提取工艺稳定可行。

表2 正交试验结果Table 2The data of orthogonal experiment

3 结论

本实验对猴腿蹄盖蕨总黄酮的超声提取工艺进行了探索研究，确定了其最佳提取工艺为料液比1∶45（g/mL）、乙醇浓度60%、提取3次、每次超声105min，在该条件下，猴腿蹄盖蕨总黄酮的提取率达到了162.71 mg/g，为猴腿蹄盖蕨总黄酮的工业化生产提供了基本的依据。

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Study on Extraction Technology of Total Flavonoids from Athyrium Mult identatum（Doll.）Ching with Ultrasonic Method

WANG Xiao-lin，ZHONG Fang-li*，XU Jing，LI Yan-qiu
（School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China）

Using extracting efficiency of total flavonoids as evaluation indicator，the extraction technology of total flavonoids from Athyrium Mult identatum（Doll.）Ching with ultrasonic method was studied with single factor and orthogonal array experiments.The optimum extraction conditions of the ratio between material and solvent（m/v），extraction time，ethanol concentration，extraction time were 1∶45，105 min，60%，3 times respectively.The average extracting efficiency of total flavonoids could reach to 162.71 mg/g under the optimum conditions，which proved that ultrasonic method was suitable for the extraction of total flavonoids from Athyrium Mult identatum（Doll.）Ching.

Athyrium Mult identatum（Doll.）Ching；total flavonoids；extraction

2014-07-11

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.006

王晓林（1969—），男（汉），副教授，硕士，主要从事天然产物有效成分的提取及纯化工艺研究。

*通信作者：钟方丽（1970—），女（汉），教授，博士。