DADS通过miR- 222抑制人胃癌细胞系的增殖与侵袭

黄宁江，刘乐江*，盘 箐，张志伟，唐海林

(1.永州职业技术学院 药学系, 湖南 永州 425000； 2.南华大学 肿瘤研究所, 湖南 衡阳 421001)



研究论文

DADS通过miR- 222抑制人胃癌细胞系的增殖与侵袭

黄宁江1，刘乐江1*，盘 箐1，张志伟2，唐海林2

(1.永州职业技术学院 药学系, 湖南 永州 425000； 2.南华大学 肿瘤研究所, 湖南 衡阳 421001)

目的通过miRNA途径研究二烯丙基二硫(DADS)的抑瘤机制，以进一步阐明DADS抑制胃癌细胞增殖与转移的分子机制。方法将胃癌细胞系MGC- 803细胞分为DADS处理组、miR- 222模拟物组、miR- 222抑制物组和阴性对照组；分别采用0、 25、 50、100、 200和400μmol/L DADS处理MGC- 803细胞；分别将miR- 222模拟物、miR- 222抑制物和scramble转染MGC- 803细胞。qRT-PCR检测MGC- 803细胞中miR- 222表达；MTT法和Transwell侵袭实验检测MGC- 803细胞增殖与侵袭能力；蛋白质印迹试验检测MGC- 803细胞中TIMP3蛋白表达。结果DADS可呈剂量依赖性下调MGC- 803细胞中miR- 222表达(P<0.05)；DADS能抑制MGC- 803细胞的增殖与侵袭，外源高表达miR- 222能促进MGC- 803细胞的增殖与侵袭，而miR- 222抑制物与DADS共同处理，MGC- 803细胞的增殖与侵袭抑制作用最为显著(P<0.05)；DADS可下调MGC- 803细胞中TIMP3蛋白的表达，外源高表达miR- 222能上调MGC- 803细胞中TIMP3蛋白的表达，而miR- 222抑制物与DADS共同处理，MGC- 803细胞中TIMP3蛋白的表达下调最为显著(P<0.05)。结论DADS通过下调miR- 222的表达，靶向TIMP3抑制胃癌细胞的增殖与侵袭。

胃癌； miR- 222； 二烯丙基二硫； 增殖与侵袭

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中提取的天然有机硫化物。近年来，大量的研究显示，DADS对多种肿瘤具有抑制作用，包括鼻咽癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌以及白血病等[1- 6]。其具体抑癌机制与激活解毒致癌物的代谢酶、抑制DNA加合物与活性氧的形成、阻滞细胞周期与诱导肿瘤细胞凋亡等有关[7]。

miRNA是一类长度约为22nt的单链，非编码RNA分子，通过与其靶基因3′非编码区(UTR)完全或不完全结合，导致翻译抑制和靶mRNA的降解，从而在转录后水平对靶基因的表达进行负调控[8]。miRNA 调控细胞增殖、分裂、分化以及凋亡等重要生物学过程，并且参与多条信号通路在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，起着癌基因或抑癌基因样作用。前期研究发现，DADS可呈时间和剂量依赖性抑制胃癌细胞的增殖与侵袭，并且还通过miRNA芯片技术，筛选DADS处理人胃癌细胞的差异miRNA表达，发现经DADS处理后胃癌细胞中miR- 222的表达与 DMSO 对照组相比下调2倍以上[5]。研究显示，miR- 222在胃癌组织中表达增高，并且与胃癌的临床分期、侵袭深度以及淋巴结转移相关[9]。因此，推测miR- 222在DADS的抗癌作用中可能发挥重要作用。本次研究旨在从miRNA这一层面进一步揭示DADS抑制胃癌生长与转移的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人胃癌MGC- 803细胞(由南华大学肿瘤研究所惠赠)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；MTT(Sigma公司)；Transwell小室(BD公司)；miR- 222模拟物、对照组和miR- 222抑制剂(由Exiqon公司设计合成)；RNA抽提试物盒(Applied Biosystems公司)；TIMP3和β-actin抗体(Santa Cruz公司)；DADS(Fluka公司)：Mr146.28，d420=1.0，纯度80%，含10%～20% DAS。

1.2 方法

1.2.1 分组：将胃癌细胞系MGC- 803细胞分为DADS处理组、miR- 222 模拟物组、miR- 222抑制物组和阴性对照组；分别采用0、 25、 50、100、 200和 400 μmol/L DADS处理MGC- 803细胞48 h；分别将miR- 222模拟物、miR- 222抑制物和对照组转染MGC- 803细胞。

1.2.2 qRT-PCR：用RNA抽提试剂盒抽提每组胃癌细胞中总RNA，并反转录合成cDNA于-80 ℃保存备用。miR- 222-(正向引物)5′-CGCAGCTACA TCTGGCTACTG-3′,(反向引物)5′-GTGCAGGGTCC GAGGT-3′; U6-(正向引物)5′-GCGCGTCGTGAA GCGTTC-3′,(反向引物)5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。PCR扩增反应体系为20 μL，其中包括Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，miR- PCR引物(5 μmol/L)0.4 μL，2×SYBR Mix 10 μL，miRNA RT产物2.0 μL，灭菌蒸馏水7.4 μL。循环体系为: 95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，一共35个循环。以U6为内参，所测定的miR- 222的相对表达量采用2-ΔΔCT法分析。

1.2.3 MTT法：将转染细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，培养至90%汇合度，每孔加灭菌MTT液(5 g/L)20 μL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min， 酶标仪测定570 nm各孔吸光度值，记录结果，实验重复3次。

1.2.4 Transwell侵袭实验：在Transwell小室中铺加适量基质胶稀释液，过夜以成膜。取100 μL即含1×105个细胞/mL的细胞稀释液接种至Transwell小室的上腔，下腔加500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养36 h，取出，用棉签擦弃小室上层细胞，PBS液轻洗，4%多聚甲醛固定，结晶祡染色，PBS液洗，倒置，晾干。光学显微镜下观察并摄相，随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值，实验重复3次。

1.2.5 Western blot：抽提每组转染48后的胃癌细胞总蛋白，每组取等量样本进行SDS-PAGE，电泳后转膜，封闭1 h，加入TIMP3抗体或β-actin抗体，4 ℃过夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL发光，X线曝光、显影和定影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 DADS对MGC803细胞miR- 222表达的影响

随着DADS剂量增加，与对照组相比，胃癌细胞中miR- 222表达量逐渐下调， (P<0.05)(图1)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control图1 qRT-PCR检测DADS对MGC- 803细胞miR- 222表达的影响Fig 1 The expression of miR- 222 regulated by DADS

2.2 DADS通过下调miR- 222抑制MGC- 803细胞增殖

转染miR- 222模拟物组48 h后，细胞的增殖能力明显增强(P<0.05)，经200 μmol/L DADS处理MGC- 803细胞后，细胞的增殖能力明显降低(P<0.05)，而miR- 222抑制物与DADS共同处理MGC- 803细胞，细胞的增殖能力降低最为显著(P<0.01)(图2)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control图2 MTT法检测DADS与miR- 222对MGC- 803细胞增殖能力的影响Fig 2 The proliferation ability of MGC- 803 cells regulated by miR- 222 and DADS were

2.3 DADS通过下调miR- 222抑制MGC- 803细胞侵袭

转染miR- 222模拟物组48 h后，穿膜细胞数明显增加(P<0.01)，经200 μmol/L DADS处理MGC- 803细胞后，穿膜细胞数明显减少(P<0.01)，而miR- 222抑制物与DADS共同处理MGC- 803细胞，穿膜细胞数减少最为显著(P<0.001)(图3)。

2.4 DADS对TIMP3蛋白表达的影响

转染miR- 222模拟物组TIMP3蛋白表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。200 μmol/L DADS处理组TIMP3蛋白表达水平较对照组明显增高(P<0.05)。而miR- 222抑制物与DADS共同处理组TIMP3蛋白表达水平较对照组增高最为显著(P<0.01)(图4)。

3 讨论

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其病死率居第二位[10]。将近一半的胃癌患者发生在中国，且大多患者就诊时已发生侵袭与转移，传统治疗疗效差，患者5年生存率在20%左右[5]。因此，开发高效、低毒的抗癌药物成为当务之急。

大量的研究显示，DADS对多种肿瘤细胞具有抑制作用，包括鼻咽癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌以及白血病[1- 6]。本文研究miR- 222对DADS的抑瘤机制。本结果显示， 随着DADS剂量增加， miR- 222表达量呈梯度明显下调，说明DADS可下调MGC803细胞中miR- 222的表达，且呈剂量依赖关系。miR- 222在胃癌患者血清中的表达明显高于慢性胃癌患者与健康人群，并且与胃癌患者的临床分期与淋巴结转移相关[11]。研究显示，miR- 222在胃癌中表达上调，通过直接调控PTEN的表达，从而促进胃癌细胞的增殖与侵袭[12]。miR- 222在HP相关胃癌细胞中表达上调，并且通过靶向RECK的表达促进胃癌细胞的增殖[13]。上述研究说明，miR- 222在胃癌中可能作为早期检测标志物与治疗靶点。

A.original magnification(×100); B.*P<0.01，**P<0.001 compared with control

*P<0.05，**P<0.01 compared with control图4 Western blot检测miR- 222与DADS对TIMP3蛋白的影响Fig 4 The expression of TIMP3 protein regulated by miR- 222 and DADS was tested by Western blot

TIMP3对组织中基质金属蛋白酶(MMPs)具有特异性的抑制作用，对维持细胞外基质的降解与合成之间的平衡起重要作用。研究显示，TIMP3在乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌表达下调，并且与肿瘤的增殖与侵袭相关[14- 16]。外源沉默结肠癌和子宫内膜癌细胞中miR- 191的表达通过上调TIMP3的表达，均可抑制结肠癌和子宫内膜癌细胞的侵袭与增殖能力。据报道，TIMP3是miR- 222直接调控的靶基因[14]。本研究显示，在胃癌细胞中外源高表达miR- 222能下调TIMP3蛋白表达水平，DADS能上调TIMP3蛋白表达，而miR- 222抑制剂与DADS共同作用，胃癌细胞TIMP3蛋白表达上调尤为明显，表明在胃癌细胞中沉默miR- 222或增加DADS处理可上调细胞中TIMP3的表达。实验显示，在胃癌细胞中外源高表达miR- 222能促进胃癌细胞的增殖与侵袭，DADS能抑制胃癌细胞的增殖与侵袭，而miR- 222抑制物与DADS共同作用，其抑制作用更为明显。

综上所述，DADS能抑制胃癌细胞的增殖与侵袭，其作用可能与下调miR- 222有关。另外，TIMP3是miR- 222的重要靶点，DADS可能通过下调miR- 222的表达，从而靶向TIMP3抑制胃癌细胞的增殖与侵袭。这些结果均提示miR- 222可作为一个潜在的治疗靶点，在DADS抑瘤作用中发挥重要作用。

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Diallyl disulfide suppresses the proliferation and invasion of human gastric cancer cell line MGC- 803 by down-regulating miR- 222

HUANG Ning-jiang1, LIU Le-jiang1*, PAN Qing1, ZHANG Zhi-wei2, TANG Hai-lin2

(1.Dept. of Parmacology, Yongzhou Vocational Technical College, Yongzhou 425000; 2.Cancer Research Institute, University of South China, Hengyang 421001, China)

Objective To identify the mechanism related to miRNA pathway which plays a role in the anti-tumor effects of Diallyl disulfide. Methods Gastric cancer cell line MGC- 803 was divided into DADS treatment group, miR- 222 mimics groups, miR- 222 inhibitors group and negative control group; MGC- 803 cells were treated with 0, 25, 50, 100, 200, 400 μmol/L DADS respectively; miR- 222 mimics, miR- 222 inhibitors and scramble sequence were transfected in MGC- 803 cells respectively. A qRT-PCR was employed for detecting the expression of miR- 222 in MGC- 803 cells. Western blotting was conducted to detect the expressions of TIMP3 protein in MGC- 803 cells. The proliferation and invasion ability of MGC- 803 cellsinvitrowere evaluated by MTT and Transwell invasion assays. Results miR- 222 expression was down-regulated by increasing doses of DADS(P<0.05); DADS could significantly inhibit MGC- 803 cell proliferation and invasion capacity, ectopic expression of miR- 222 could significantly promote MGC- 803 cell proliferation and invasion capacity. Furthermore, gastric cancer cells treated with combination of DADS and miR- 222 inhibitors showed significant inhibition to cell proliferation and invasion (P<0.05); The expression of TIMP3 protein was inhibited by treatment with DADS in MGC- 803 cells, overexpression of miR- 222 resulted in increased TIMP3 protein levels. Furthermore, the expression of TIMP3 protein was inhibited as treated with combination of DADS and miR- 222 inhibitors(P<0.05). Conclusions DADS suppresses proliferation and invasion of human gastric cancer cells through targeting at TIMP3 by down-regulation of miR- 222.

gastric cancer; miR- 222; diallyl disulfide; proliferation and invasion

2015- 04- 02

2015- 07- 03

国家自然科学基金(31100935);永州市科技计划项目[(2012)17号- 22]

1001-6325(2015)12-1596-05

R735.2

A

*通信作者(corresponding author)：176024235@qq.com