EGFR敏感突变肺腺癌患者纵膈淋巴结转移相关基因的检测与分析

蓝保华，兰卫华，李 钱，张志敏，何 昊，李梦侠，杨镇洲*

(第三军医大学大坪医院 野战外科研究所 1.肿瘤中心； 2.泌尿外科， 重庆 400042)



研究论文

EGFR敏感突变肺腺癌患者纵膈淋巴结转移相关基因的检测与分析

蓝保华1，兰卫华2，李 钱1，张志敏1，何 昊1，李梦侠1，杨镇洲1*

(第三军医大学大坪医院 野战外科研究所 1.肿瘤中心； 2.泌尿外科， 重庆 400042)

目的本研究采用转录组测序和生物信息学分析等方法，以期筛选出肺腺癌淋巴结转移相关基因。方法分别检测伴和不伴纵膈淋巴结转移的EGFR敏感突变肺腺癌临床标本转录组表达谱，筛选出差异表达基因(DEGs)；对这些DEGs进行相关生物信息分析，探索这些基因在淋巴结转移进程中可能发挥的作用。q-PCR法验证高表达基因在PC9细胞株(EGFR敏感突变细胞株)中的表达情况。结果共检测了10例肺腺癌标本的转录组表达谱，通过差异基因表达分析筛选出169个DEGs，其中，68个在肺腺癌样本中表达上调、101个基因表达下调。q-PCR结果显示：高表达基因在PC-9细胞中，ZNF572、BRPF3、MMACHC等7个基因的表达量为中丰度, SMOC1、A1BG、BARX1等9个基因为低丰度,其余均为高丰度。结论TFF3及DUSP6等多个差异表达基因可能涉及肺腺癌纵膈淋巴结转移进程。

肺腺癌；淋巴结转移；转录组测序；差异表达基因

肺癌病死率在中国和世界上多数国家已居癌症之首，其最常见病理类型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，约占所有肺癌的80%～85%[1]。

肺癌治疗策略的优化依靠准确的病理分期。目前IASLC(International Association for the Study of Lung Cancer)病理分期[2]包括：肿瘤大小(T)、区域淋巴结转移情况(N)和是否存在淋巴结外转移(M)。对临床上0期、Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲa期患者，选择外科手术可以获益；对于纵膈淋巴结转移患者，新辅助化疗可以延长其术后生存期；而对无手术适应证的患者，明确淋巴结分期可有效缩小放疗靶区照射面积，从而减少放射性肺损伤的发生率。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)敏感突变肺腺癌是酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKIs)治疗的适应证，TKIs治疗可有效延长EGFR敏感突变肺腺癌患者生存期。然而，针对EGFR突变人群，放疗联合TKI治疗的疗效值得进一步探索，因为两者联合使用时加重放射性肺损伤等不良反应。因此，如果能有效缩小纵膈淋巴结的照射区域，将使EGFR-TKIs同步放疗成为可能。

为了减少背景的干扰因素，以利于发现目的基因；同时，便于后续探讨EGFR-TKIs同步放疗可行性，本研究选取了10例女性EGFR敏感突变肺腺癌患者，使用转录组测序和生物信息学分析等方法，筛选淋巴结转移相关基因，以期找出具有预测肺腺癌有无淋巴结转移的分子标记。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:纳入标准：1)研究对象为病理证实的肺腺癌患者；2)女性；3)无吸烟史；4)行肺叶切除术或肺切除术，并行淋巴结清扫，经病理检查明确有无淋巴结转移；5)EGFR敏感突变阳性；6)术前未接受辅助化疗或放疗。获得新鲜样本后，迅速清洗后置入-80 ℃液氮罐中保存直至使用时取出。同时，留取部分样本做病理评估；病理类型划分依据WHO肺部肿瘤分类方法[3]，请有经验的病理科医师使用恒冷箱切片机和苏木精染色评估样本中肿瘤细胞的含量(肿瘤细胞平均含量>90%)。标本采集及使用均经第三军医大学大坪医院野战外科研究所伦理委员会批准通过，手术患者均签署知情同意书。

1.1.2 材料:Trizol(Life Technologies公司)；紫外线分光光度计ND- 1000 Nanodrop(Thermo Fisher公司)；Agilent 2200 Tape Station(Agilent Technologies公司)；TruSeq®RNA LT/HT Sample Prep Kit、HiSeq2500(Illumina公司)； PC- 9细胞系(Abcam公司)；dNTPs(Promega公司)等。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取:使用Trizol提取总RNA；使用紫外线分光光度计检测RNA样品的纯度和浓度；使用1.5%琼脂糖凝胶电泳(135V，20 min)分析RNA降解程度及是否有污染；Agilent 2200 Tape Station检测总RNA的完整度。

1.2.2 转录组测序:通过质检的样品，以1 μg起始量，用TruSeq®RNA LT/HT Sample Prep Kit按使用指南进行文库构建。用Agilent 2200 Tape Station进行cDNA文库质检，文库片段平均长度270 bp为通过质检。按照HiSeq2500使用指南对通过质检的文库进行测序。

1.2.3 Differentially expressed genes(DEGs)分析:使用DEGseq软件(版本1.2.2)进行差异表达分析。以差异倍数(log(fold change)的绝对值)>2及q<0.05作为临界值，筛选DEGs；并使用R软件对DEGs做聚类分析。

1.2.4 DAVID在线分析:基于GeneOntology(GO)数据库与京都基因及基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)两个数据库对DEGs进行相关分析。

1.2.5 蛋白相互作用网络分析:基于String数据库找蛋白相互作用关系，本研究参与蛋白相互作用关系的蛋白偏多，采用朴素贝叶斯整合算法，挑选相关系数大于0.993的蛋白使用Cytoscape软件进行作图。

1.2.6 q-PCR验证:q-PCR法验证转录组测序数据分析后获得的高表达基因在PC- 9细胞株中的表达情况。

2 结果

共收集到72例肺腺癌及区域淋巴结新鲜标本，符合纳入标准的标本的共10例，女性，年龄51～72岁，有、无淋巴结转移的各5例。

2.1 转录组测序及DEGs分析

转录组测序分别检测出两组的全转录组基因。使用Cuffdiff软件分析挑选出169个DEGs。这些基因中， 68个DEGs在伴淋巴结转移肺癌样本中表达上调(表1)；101个DEGs表达下调(表2)。其中，三叶草因子3(trefoil factor3，TFF3)及双特异性磷酸酶6(dual specificity phosphatase6，DUSP6)等基因既往文献报道与肺癌的发生或进展关系密切。这些DEGs聚类分析结果见图1。

2.2 GO功能富集分析

根据分子功能分析，DEGs主要涉及：各种蛋白和受体的黏合、复合受体活性、过氧化酶活性、蛋白激酶抑制剂活性等；依据生物过程分析，DEGs主要与细胞氧化应激反应、调节细胞增殖、血管的发展、细胞迁移、细胞分化等功能相关；细胞组成分析，DEGs主要定位于细胞外基质、细胞质囊泡、细胞间连接区域、胶原等位置。

2.3 KEGG通路分析

KEGG通路分析发现，DEGs涉及135个通路,其中，有10条通路在5个及以上样本中显著变化(表3)。PI3K-Akt信号通路变化在样本中出现的频率最高，功能主要涉及：细胞凋亡、蛋白合成、代谢以及细胞周期等，其次为代谢通路、黏着斑、补体及凝血级联以及癌症通路等。

2.4 蛋白相互作用网络分析

共有74个蛋白存在相互作用(图2)。如：ALPL与AOC3、 BMP2、 DES、 ERBB2、F3、HSD17B6、

表1 差异倍数前10位高表达基因

表2 差异倍数前10位低表达基因

Columns represent primary lung adenocarcinoma tissues (1,5 tissues without node metastasis and 6,10 tissues with node metastasis); rows show the 169 DEGs (68 overexpressed and 101 underexpressed in node metastases); the heatmap indicates up regulation (red), down regulation (green) and average gene expression (black)

图1 样本间差异表达基因聚类分析热图

Fig 1 Hierarchical clustering of DEGs

IL6、JUNB、KLF4、LGALS4、PLAT和VWF等多个基因存在相互作用；CAV1与EMP2、ERBB2、GRB7、ID1、ITGB3、KLK6、KLK7、PRB1和SDPR等多个基因存在相互作用。

2.5 q-PCR结果

转录组测序获得的高表达基因在PC- 9细胞中，基因ZNF572、BRPF3、MMACHC、RPS6KL1、SIX2、SKIV2L、THTPA、 USP49、 ZNF607、 MRM1表达量为中丰度；基因SMOC1、A1BG、BARX1、CCDC87、LRRTM1、SRPK3、TBX20、USH1G、BARX2表达量为低丰度,其余基因表达高峰度。

表3 5个及以上样本差异表达基因涉及KEGG通路

Red indicates up-regulation, green indicates down-regulation图2 DEGs蛋白相互作用网络图Fig 2 Protein-protein interaction network of DEGs

3 讨论

深度测序技术与生物信息学分析软件的不断发展使得基因组大数据与网路分析整合的研究日益普遍，这有助于我们更加全面地了解疾病的分子机制[4]。本研究发现淋巴结转移相关基因可能涉及细胞氧化应激反应、调节细胞增殖、血管的发展、细胞迁移、细胞分化等病理进程。这些DEGs中，三叶草因子3(trefoil factor3，TFF3)及双特异性磷酸酶6(dual specificity phosphatase6，DUSP6)在伴淋巴结转移的肺腺癌样本中分别显著高、低表达。TFF家族由3种热稳定、蛋白酶抵抗蛋白组成：TFF1、TFF2和TFF3。其正常的功能是修护黏膜表层，维持其完整性[5]。近期研究表明，TFF3在肺腺癌中的表达较肺鳞癌中更为普遍[6]。此外，TFF3的表达与乳腺癌内分泌治疗的应答相关，能够激发乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，促进肿瘤的播散，是有效预测乳腺癌转移的标志[7- 8]，其表达与结肠癌的发生与转移也相关[9]。DUSP家族蛋白可以使丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸残基脱磷酸化，通过使ERK、JNK和p38等3种蛋白的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸残基脱磷酸化来调节MAPKs，从而调节细胞增殖和生长[10]。近期研究表明，DUSP6可以通过改变胰岛素样生长因子结合蛋白7 (IGFBP7)的活性来调节肺癌对铂类药物的敏感性[11]。

既往研究表明，EGFR敏感突变肺腺癌患者使用TKIs治疗可以明显延迟生存期[12]；体外试验显示，使用TKIs(厄洛替尼、吉非替尼等)可以增加非小细胞肺癌的放射敏感性[13]。然而，两者联合使用增加放射性肺损伤的发生概率。因此，后续研究将对本研究获得的DEGs进行高含量筛选(high content screening)，筛选出肺腺癌淋巴结转移相关基因，并对这些基因进行相关功能验证，评估其预测淋巴结转移的准确性、敏感性、特异性，以期获得可以准确预测肺腺癌纵膈淋巴结转移相关基因，从而有效缩小放疗靶区勾画，减少放射性肺损伤的发生，使TKIs联合放疗成为可能。

[1] Siegel R, Ma J, Zou Z,etal. Cancer statistics, 2014[J], CA Cancer J Clin, 2014, 64:9- 29.

[2] Detterbeck FC, Boffa DJ, Tanoue LT. The new lung cancer staging system[J], Chest, 2009, 136:260- 271.

[3] Brambilla E, Travis WD, Colby TV,etal. The new World Health Organization classification of lung tumours[J]. Eur Respir J, 2001,18:1059- 1068.

[4] 乔子君,马文丽,郑文玲.肥胖患者性别差异的基因表达谱数据分析[J].基础医学与临床,2015,35:723- 728.

[5] May FE.The potential of trefoil proteins as biomarkers in human cancer[J]. Biomark Med, 2012, 6: 301- 304.

[6] Wang XN, Wang SJ, Pandey V,etal.Trefoil factor 3 as a novel biomarker to distinguish between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma[J]. Medicine (Baltimore), 2015, 94: e860. doi: 10.1097/MD.0000000000000860.

[7] May FE, Westley BR. TFF3 is a valuable predictive biomarker of endocrine response in metastatic breast cancer[J]. Endocr Relat Cancer, 2015, 22: 465- 479.

[8] Pandey V, Wu ZS, Zhang M,etal.Trefoil factor 3 promotes metastatic seeding and predicts poor survival outcome of patients with mammary carcinoma[J]. Breast Cancer Res, 2014, 16:429- 449.

[9] Huang YG, Li YF, Wang LP,etal. Aberrant expression of trefoil factor 3 is associated with colorectal carcinoma metastasis[J]. J Cancer Res Ther, 2013, 9: 376- 380.

[10] Owens DM, Keyse SM. Differential regulation of MAP kinase signalling by dual-specificity protein phosphatases[J]. Oncogene, 2007, 26: 3203- 3213.

[11] Okamura J, Huang Y, Moon D,etal. Downregulation of insulin-like growth factor-binding protein 7 in cisplatin-resistant non-small cell lung cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2012, 13: 148- 155.

[12] Petrelli F, Borgonovo K, Cabiddu M,etal. Efficacy of EGFR tyrosine kinase inhibitors in patients with EGFR-mutated non-small-cell lung cancer: a meta-analysis of 13 randomized trials[J].Clin Lung Cancer, 2012, 13: 107- 114.

[13] Gao Z1, Zhuang L, Chen Y. Effect and mechanism of gefitinib inhibition on non-small cell lung cancer radiosensitivity of HCC827 and H358 cell lines[J]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 2012, 15:324- 331.

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木瓜好处知多少

据美国国家科学院院报(PNAS)网站(2014- 05- 16)报道，木瓜素有“百益果王”之称，一般来说，一颗中型大小的木瓜热量约120卡，碳水化合物约占30 g，蛋白质约2 g。木瓜富含叶酸、镁、铜、维生素A、B、E、β胡萝卜素、纤维等植物营养素，会降低心血管疾病、糖尿病、癌症等风险，同时对消化系统、伤口愈合复原也有帮助。

多项研究显示，木瓜当中的抗氧化物质可以帮助过滤对眼睛有害的蓝光，减少发生黄斑部病变的伤害；β胡萝卜素对气喘、结肠癌、年轻男性前列腺癌有预防效果；维生素K对骨骼健康有益；高纤维可改善糖尿患者的血糖浓度、一般人的便秘问题以及预防心脏病；维生素A可让头发保持滋润；维生素C则可建造与维持胶原蛋白，同样对皮肤与头发都非常重要。

此外，将捣碎的木瓜泥中所含有的蛋白水解酶敷在伤口上，也会有助伤口复原、避免感染。

木瓜食用的方法有很多，除了可以去籽后直接吃，也可以将木瓜、苹果及芒果等热带水果一起做水果沙拉/或与其他材料一起做成莎酱，甚至加入柠檬汁、冰茶中或做成冰沙等方式食用，一种水果可以拥有多种风味。

但最后要提醒对乳胶过敏者，木瓜的某些蛋白质组成成分和乳胶蛋白相似，会引起交叉过敏反应。

该研究刊登于新一期MedicalNewsToday。

Detection and analysis of mediastinal lymph node metastasis associated genes of lung adenocarcinoma in patients with EGFR sensitive mutations

LAN Bao-hua1, LAN Wei-hua2, LI Qian1, ZHANG Zhi-min1, HE Hao1, LI Meng-xia1, YANG Zhen-zhou1*

(1.Cancer Center; 2.Dept. of Urology, Institute of Surgical Research, Daping Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)

Objective To identify the mediastinal lymph node metastasis associated genes of lung adenocarcinoma. Methods Using the transcriptome sequencing method, we examined 10 cases of lung adenocarcinoma samples with EGFR sensitive mutation. Comparing the two groups of the transcriptome expression profiles, differentially expressed genes (DEGs) were analyzed, bioimformatics methods were used to analyze the role of these genes. q-PCR detected the expression of the upregurated genes in PC- 9 cell lines (EGFR sensitive mutation cell lines). Results There were 68 DEGS up-regulated and 101 genes down-regulated in the lung adenocarcinoma samples. q-PCR showed that the aboundance of 7 genes(ZNF572,BRPF3,MMACHC and so on.) in upregurated genes was low, nine genes(SMOC1,A1BG,BARX1 and so on.) was moderate, and others was high. Conclusions TFF3, DUSP6 and other DEGs may be involved in the process of mediastinal lymph node metastasis in lung adenocarcinoma.

lung adenocarcinoma; lymph node metastasis; transcriptome sequencing; differentially expressed genes

2015- 06- 03

2015- 10- 08

国家自然科学基金(81272499)

1001-6325(2015)12-1606-06

R734.2

A

*通信作者(corresponding author)：yangzz1970@163.com