云南汉族ATP2B1基因标签SNPs与原发性高血压的关系

吴艳瑞，杨红菊，李 茜，苏 航，夏 涵，王丽琼，肖春杰*

(1.昆明医科大学 细胞生物学与医学遗传学系， 云南 昆明 650500； 2.昆明医科大学第一附属医院， 云南 昆明 650500；3.云南大学 人类遗传学研究中心， 云南 昆明 650091)



研究论文

云南汉族ATP2B1基因标签SNPs与原发性高血压的关系

吴艳瑞1，杨红菊2，李 茜3，苏 航2，夏 涵2，王丽琼1，肖春杰3*

(1.昆明医科大学 细胞生物学与医学遗传学系， 云南 昆明 650500； 2.昆明医科大学第一附属医院， 云南 昆明 650500；3.云南大学 人类遗传学研究中心， 云南 昆明 650091)

目的探讨Ⅰ型细胞膜钙离子转运酶(ATP2B1) 基因标签单核苷酸多态(SNPs)与云南汉族原发性高血压(EH)的相关性。方法用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，检测1020例云南汉族人(EH组和对照组各510例)ATP2B1基因12个标签 SNPs (rs10506974、rs10506975、rs2854371、rs957525、rs3741895、rs2681472、rs2070759、rs12423192、rs1050395、rs11105357、rs11105358和rs7975689)和ATP2B1基因附近区域的rs17249754位点的多态性。结果rs17249754位点基因型和等位基因频率在EH组和对照组间的分布均具有显著性差异(P<0.01)，Logistic回归分析发现，rs17249754位点AA基因型和A等位基因使EH患病风险显著性降低(OR=0.60，95%CI 0.40～0.89，校正P<0.05；OR=0.73，95%CI 0.60～0.88，校正P<0.01)。结论ATP2B1基因附近区域rs17249754位点与云南汉族人群EH相关，rs17249754 A等位基因可能是降低云南汉族EH风险的保护因子。

ATP2B1；原发性高血压；标签SNPs；汉族

高血压已成为全球首要致死危险因素，原发性高血压(essential hypertension，EH)占高血压患者的95%以上，其发病机制目前尚不完全清晰。全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)为剖析高血压相关新位点提供了线索。两项GWAS研究发现多个高血压相关基因，并在大样本列队人群中得到交叉验证[1- 2]。Ⅰ型细胞膜钙离子转运酶(plasma membrane calcium transporting ATPase 1，ATP2B1) 基因与欧洲人高血压最相关，这种关联在日本和韩国人中得到验证[3- 4]。ATP2B1基因与高血压的研究也在中国汉族(北京、上海、泰州和哈尔滨)中开展[5- 7]，但研究结果不一致。中国汉族具有错综复杂的亚结构，因此对待基于中国汉族人群得出的显著性差异结论必须非常谨慎，尤其当研究样本来自不同地区[8]。本研究期望探究ATP2B1基因与云南汉族原发性高血压的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2003年至2006年采自云南省第三人民医院和延安医院的研究样本1 020例。样本选择标准如前所述[9]：高血压患者510例，按照1999年WHO/ISH诊断标准，收缩压≥140 mmHg，和/或舒张压≥90 mmHg，或正在接受高血压治疗者，排除继发性高血压、服用避孕药史和糖尿病史；正常对照个体510例，按照1999年WHO/ISH诊断标准，收缩压<140 mmHg和舒张压<90 mmHg，无高血压病史。根据“知情同意”原则，抽取5 mL静脉血液。本研究获得昆明医科大学伦理委员会批准。正常对照组和高血压组基本信息见表1。

1.2 所用主要试剂(盒)名称及来源

引物碱基合成、dNTPs(上海生物工程有限公司)；Taq DNA聚合酶(大连TaKaRa公司)；限制性内切酶(FERMENTAS公司)。

1.3 基因组DNA提取和标签SNPs基因分型

用Gross-Bellard(1973)[10]酚-氯仿法抽提基因组DNA，定量标化至0.03 ng/μL，-80 ℃保存。

表1 高血压组与对照组一般临床指标的比较

parametersnormotensivehypertensivegender(male/female)335/175335/175age/(years) 5346±10445381±1023SBP/(mmHg) 1115±110914792±2067∗DBP/(mmHg) 7353±7079475±1304∗BMI/(kg/m2) 2298±2792464±281∗TC/(mmol/L)547±314520±114TG/(mmol/L)200±152250±204∗

continuous variable are expressed as mean±SD; abbreviations:SBP.systolic blood pressure; DBP.diastolic blood pressure; BMI.body mass index; TC.total cholesterol; TG, triglyceride;*P<0.01 compared with normotensive.

根据HapMap数据库(http://www.hapmap.org/index.html.ja)中国人群SNPs基因型信息，按照r2≥0.8和低频等位基因频率≥0.01的标准，筛选出ATP2B1基因12个标签 SNPs(rs10506974、rs10506975、rs2854371、rs957525、rs3741895、rs2681472、rs2070759、rs12423192、rs1050395、rs11105357、rs11105358和rs7975689)，筛选效力如前所述[9]。另外，位于ATP2B1基因附近的rs17249754位点也纳入本研究。

查询ATP2B1基因全序列(http://www.ensembl.org/index.html)，用Primer Premier 5.0 软件设计引物。用巢式PCR-RFLP方法，对13个多态位点进行基因分型。PCR反应体系(15 μL)：0.5 U Taq DNA聚合酶，1.5μL 10×缓冲液，1 μL dNTPs，20 pmol/μL上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA(30 ng)，用重蒸馏水(ddH2O)补足15 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s(32个循环)；72 ℃充分延伸5 min。酶切体系(10 μL)：1 μL 10×缓冲液，3 U限制性内切酶，2 μL PCR产物，用ddH2O补足10 μL，恒温反应24 h。酶切产物用3%琼脂糖凝胶，200 V电压电泳约20 min，溴化乙啶染色，数码凝胶成像系统观察酶切产物，确定基因型。

1.4 统计学分析

分析基因型、等位基因和单倍型频率分布(SHEsis)；进行EH组与对照组间基因型及等位基因的logistic回归分析，估算相对风险度(odds ratio,OR)及95%可信区间(confidence interval, CI)(SPSS15.0)。

2 结果

2.1 EH组和对照组间的一般资料比较

EH组收缩压、舒张压、体质指数和三酰甘油水平显著高于对照组(P<0.001)。

2.2 13个多态位点基因型和等位基因频率分布

rs17249754位点基因型和等位基因频率在EH组和对照组间的分布均具有显著性差异(P<0.001和P<0.01)。rs2681472位点基因型频率在EH组和对照组间的分布均具有显著性差异(P<0.05)，但经Bonferroni校正失去统计学意义(表2)。

2.3 rs2681472和rs17249754位点与EH的风险度分析

rs17249754位点AA基因型和A等位基因使EH患病风险显著降低(OR=0.60，95%CI 0.40～0.89，校正P<0.05；OR=0.73，95%CI 0.60～0.88，校正P<0.01)(表3)。

表2 ATP2B1基因13个SNPs基因型和等位基因频率分布

aThe major allele was referred to as allele 1 and the minor allele as allele 2;*P<0.05 compared with control group after Bonferroni correction.

表3 rs2681472和rs17249754位点与原发性高血压的风险度分析

abbreviations:OR, odds ratio; 95%CI, 95% confidence intervals；athe major allele was referred to as allele 1 and the minor allele as allele 2；bOR estimated by logistic regression analysis, adjusted for gender, age, BMI；*P<0.05 compared with control group;**P<0.01 compared with control group.

3 讨论

GWAS研究发现了新的高血压易感基因，引人注目的是，这些基因并不是以往控制高血压处方药的靶标，因此GWAS研究结果可能会改进高血压早期检测系统和治疗方案。ATP2B1基因位于12q21.3，长约68.0 2kb，包含21个外显子和20个内含子，编码Ⅰ型细胞膜钙离子转运酶，对血管平滑肌收缩和舒张具有重要作用。

ATP2B1基因是否与欧洲以外人群高血压的发生相关，是人们迫切关心的问题。研究者在其他人群相继开展了ATP2B1基因与高血压的关联研究，发现该基因与韩国人和日本人高血压发生相关[3- 4]。中国人群ATP2B1基因单个SNP位点与高血压的关联研究均未检测到相关性[5]；但同时开展多个SNPs位点的研究发现ATP2B1基因rs17249754位点与上海和哈尔滨汉族人高血压发生相关[6- 7]，以往复杂疾病研究也表明单个SNP检测很难得到重复性结论，而多基因或多位点的检测效力更高[11- 12]。有学者认为个体的表型差异和疾病的易患性程度是由个体基因组的某些位点，例如SNPs的变异引起的。依据SNPs位点间的连锁不平衡情况，可以挑选出具有代表其他SNPs位点的少数标签SNPs。国际人类基因单体型图(human haplotype map，HapMap)的完成使基于标签SNPs的疾病关联研究成为可能，并且成为研究复杂疾病的有效手段[13]。

鉴于上述原因，本研究采取基于标签SNPs的研究策略，并对文献集中关注的ATP2B1基因附近区域的多态位点也进行研究，结果发现rs17249754位点与云南汉族EH发生相关，基因型和等位基因频率在EH组和对照组间的分布具均有显著性差异，Logistic回归分析提示rs17249754位点AA基因型和A等位基因显著降低EH患病风险，rs17249754位点低频A等位基因在EH组和对照组中的频率分别是0.313和0.384，与中国上海和哈尔滨汉族人群中检测到的频率相似且研究结果一致[6- 7]，因此该位点可能是中国汉族EH相关遗传标记，在中国汉族人群中值得关注。鉴于EH发生机制的复杂性和不同遗传背景的影响，在更多其他人群中开展ATP2B1基因与EH的研究非常必要，这将为EH早期预防和治疗提供理论支持。

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Association of tag SNPs in theATP2B1 gene with essential hypertension in Han population from Yunnan Province

WU Yan-rui1, YANG Hong-ju2, LI Qian3, SU Hang2, XIA Han2, WANG Li-qiong1, XIAO Chun-jie3*

(1.Dept. of Cell Biology and Medical Genetics, Kunming Medical University, Kunming 650500; 2.the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650500; 3.Human Genetics Center, Yunnan University, Kunming 650091, China)

Objective To identify the association of tag single nucleotide polymorphisms (tag SNPs) of plasma membrane calcium transporting ATPase1 (ATP2B1) gene with essential hypertension (EH) in Han population from Yunnan. Methods A case-control study was carried out. Twelve tag SNPs (rs10506974, rs10506975, rs2854371, rs957525, rs3741895, rs2681472, rs2070759, rs12423192, rs1050395, rs11105357, rs11105358 and rs7975689) and rs17249754 near theATP2B1 gene were genotyped in 510 patients with EH and 510 healthy controls using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method (PCR-RFLP). ResultsThe genotype and allele distributions of rs17249754 between the case subjects and controls had significant difference (P<0.01), and Logistic regression analysis showed that AA genotype and A allele reduced the risk of EH (OR=0.60, 95% CI 0.40～0.89,P<0.05;OR=0.73, 95% CI 0.60～0.88,P<0.01). Conclusions The rs17249754 near theATP2B1 gene is a potential genetic marker for EH and A allele may be a protective factor for EH in Han population.

ATP2B1; essential hypertension; tag SNPs; Han population

2015- 07- 06

2015- 10- 10

云南省应用基础研究计划项目(2013FZ053、2014FB005); 云南省教育厅科学研究基金 (2013Y288); 云南公共卫生与疾病防控协同创新中心项目(2014YNPHXT05)

1001-6325(2015)12-1617-05

R394

A

*通信作者(corresponding author)：chjxiao@ynu.edu.cn