大川芎方HPLC指纹图谱方法学研究

沈　伟，张一文，李赫宇（.山东中医药高等专科学校，山东烟台6499；.天津市益倍建生物技术有限公司，天津300457）

大川芎方HPLC指纹图谱方法学研究

沈伟1，张一文1，李赫宇2
（1.山东中医药高等专科学校，山东烟台264199；2.天津市益倍建生物技术有限公司，天津300457）

摘要：建立大川芎方HPLC指纹图谱方法学。考察色谱条件，选择合适的分析波长，考察方法的精密度、重现性、稳定性等。结果表明：色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色谱柱，流动相甲醇-1%醋酸梯度洗脱：0 min→35 min，A：5%→35%；35 min→50 min，A：35%→80%；50 min→60 min，A：80%→80%；60 min→65 min，A：80%→5%；柱温：30℃；流速：1 mL/min；检测波长270 nm。在上述条件下，所建立方法的精密度、重现性、稳定性等良好。所建立的大川芎方HPLC指纹图谱方法学为该方的定性、定量分析提供了新方法。

关键词：大川芎方；高效液相色谱；指纹图谱

大川芎方源于金·刘完素《宣明论方》，由川芎、天麻两味药组成。川芎，又名大川芎，为伞形科多年生草本植物川芎的根茎，为四川特产药材，性味辛温，有活血行气，祛风止痛之功，诸多月经不调、痛经、头痛等的药膳中多用川芎。天麻具有对神经细胞损伤的保护、抗惊厥、镇静催眠等作用[1]，同时亦具有较高的营养价值与保健功效，在民间有很多种做法，常用于保健食疗[2]。川芎、天麻配合使用，即可作为治疗偏头痛的经典中药复方，同时又是制备保健食品的常用配对原料[3]。由于方中川芎和天麻所含化学成分分子结构、极性等差异较大，在目前的文献报道中，一般需分别建立定性、定量分析方法。本文建立了大川芎方的HPLC指纹图谱分析方法，能简便、快速、准确地进行定性、定量分析，为该方与相应保健食品的质量控制提供了有效手段。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

洋川芎内酯 I对照品（批号：140226，纯度HPLC≥98%）：成都克洛玛生物科技有限公司；阿魏酸对照品（批号773-9001）：中国药品生物制品检定所；天麻素对照品（批号110807-200205）：中国药品生物制品检定所；川芎药材经山东中医药高等专科学校中药鉴定教研室张钦德教授鉴定为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎：购于上海泰坤堂中医院（产地云南，批号20121028）；天麻药材经山东中医药高等专科学校中药鉴定教研室张钦德教授鉴定为兰科植物天麻Gastrodia elata B1.的干燥块茎：购于上海泰坤堂中医院（产地云南，批号20121028）。

甲醇：色谱级，美国天地（TEDIA）试剂公司；其余试剂为分析纯。

1.2仪器

SHIMADZU高效液相色谱仪（LC-2010A HT），配备DAD二极管阵列检测器、四元泵、自动进样器、LC-solution色谱工作站；TU-1900紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1色谱条件

色谱柱：HypersilODS2C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-1%醋酸，按表1程序梯度洗脱；柱温：30℃；流速：1 mL/min。

表1　流动相梯度洗脱变化程序Table 1　The gradient elution procedure

1.3.2供试品溶液的制备

1.3.2.1川芎效应组分的制备方法

川芎粗粉，分别加12倍量、10倍量、8倍量70%乙醇，回流提取3次（1.5、1、0.5 h），滤过，合并滤液，减压回收乙醇，真空干燥，得川芎效应组分干浸膏。

1.3.2.2天麻效应组分的制备方法

天麻粗粉，加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，真空干燥，得天麻效应组分干浸膏。

1.3.2.3大川芎方供试品溶液的制备方法

称取川芎、天麻干浸膏（生药量4∶1）于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声溶解10 min，经0.45 μm有机相微孔滤膜滤过，即得60 mg/mL的大川芎方供试品溶液。

1.3.2.4阿魏酸对照品溶液的制备方法

精密称取FA对照品4.6 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得46 μg/mL的FA对照品溶液。

1.3.2.5天麻素对照品溶液的制备方法

精密称取GS对照品3.0 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得30 μg/mL的GS对照品溶液。

1.3.2.6洋川芎内酯I对照品溶液的制备方法

精密称取SI对照品14.8 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得1.48 mg/mL的SI对照品储备液。精密量取1 mL储备液于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得14.8 μg/mL的SI对照品溶液。

2　结果与分析

2.1检测波长的选择

精密量取川芎、天麻效应组分干浸膏，分别置100 mL容量瓶中，另取100 mL容量瓶，按川芎、天麻生药量4∶1的比例称取干浸膏，均加甲醇稀释至刻度，超声溶解。精密吸取一定量的川芎效应组分溶液、天麻效应组分溶液和大川芎方效应组分溶液，转移置100 mL容量瓶中，制成0.4 mg/mL的川芎供试品、1.0 mg/mL的天麻供试品和3.0 mg/mL的大川芎方供试品，以甲醇为空白，在200 nm～400 nm波长范围内进行扫描。结果见图1。

图1　全波长扫描图Fig.1　Full-wavelength scan diagram

根据紫外扫描结果可知，川芎效应组分在280 nm 和320 nm波长下均有较稳定的吸收。天麻效应组分在270 nm波长下有较稳定的吸收。大川芎方效应组分在280 nm波长下有较稳定的吸收。

本试验重点考查了大川芎方效应组分270、280、320 nm检测波长下的色谱图，见图2。

图2　大川芎方HPLC图谱Fig.2　HPLC fingerprint diagram of Dachuanxiong formula

结果表明：270 nm色谱图各色谱峰的响应值较高，出峰数目多，故检测波长定为270 nm。

2.2参照物的选择

FA对照品、GS对照品、SI对照品的色谱图见图3。

图3　对照品色谱图Fig.3　Chromatogram of three reference substances

其中保留时间为31.1 min的FA色谱峰（见图3，3号峰）是HPLC图谱中峰面积较大、出峰时间适中且很稳定的色谱峰，选择该峰作为参照。

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验

取同一批次大川芎方效应组分干浸膏，制备供试品溶液，连续进样6次，测定。结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<5%，表明仪器精密度良好。

2.3.2重现性试验

取同一批次大川芎方效应组分干浸膏，平行制备6份供试品溶液，测定。结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<5%，表明方法重现性良好。2.3.3稳定性试验

取同一批次大川芎方效应组分干浸膏，制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h进样分析，测定。结果：各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<5%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4指纹图谱的测定及结果

制备10批川芎、天麻效应组分干浸膏，并按供试品溶液制备方法平行制备10份供试品溶液，测定HPLC色谱图，记录65 min的色谱图谱，结果见图4。

图4　大川芎方效应组分10批样品指纹图谱Fig.4　HPLC fingerprints of 10 batch samples of Dachuanxiong formula effective extracts

经与图3对照品色谱图比较得知，1号峰为GS峰，3号峰为FA峰，6号峰为SI峰。以FA色谱峰的保留时间和峰面积的积分值为1，计算各共有峰的相对保留时间和峰面积比，其值RSD<5%。结果表明，所建立的指纹图谱分析方法有较好的重现性及稳定性，可用于大川芎方的定性、定量分析。

3　讨论

以往的大川芎方研究者常以其中的一到两种主要成分（FA、GS）作为研究指标，但川芎、天麻所含化学成分较为复杂，仅以一到两种成分为指标进行研究显然无法体现该方的整体作用特点，故建立大川芎方化学成分的指纹图谱是十分必要的。本文所建立的大川芎方效应组分HPLC指纹图谱测定方法，方法学研究表明所建立的方法准确、稳定、简便易行，色谱图中色谱峰最为丰富，能相对全面的反映出大川芎方中所含的复杂化学成分体系，不仅可以用于大川芎方、大川芎方制剂或川芎、天麻药对药膳、保健食品物质基础的探究，也可以为该方及相应保健食品的质量控制提供强有力的技术手段。

参考文献：

[1]W Liu,B L Su,Z S Wang,et al.Gastrodin Improved Baroreflex Sensitivity and Increased Gamma-Amino Butyric Acid Content in Brains without Decreasing Blood Pressure in Spontaneously Hypertensive Rats[J].CNS Neurosci Ther,2012,18:873-875

[2]赵杨,康志娇,周欣,等.药食两用植物-天麻[J].贵州师范大学学报(自然科学版),2013,31(4):9-12

[3]L Wang,J Zhang,Y Hong,et al.Phytochemical and Pharmacological Review of Da Chuanxiong Formula:A Famous Herb Pair Composed of Chuanxiong Rhizoma and Gastrodiae Rhizoma for Headache[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:42,53,69

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.041

收稿日期：2015-07-02

作者简介：沈伟（1982—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：中药化学与中药炮制学。

The HPLC Fingerprint Analysis of Dachuanxiong Formula

SHEN Wei1，ZHANG Yi-wen1，LI He-yu2
（1.Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai 264199，Shandong，China；2.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.Ltd.，Tianjin 300457，China）

Abstract：To develop HPLC chromatographic fingerprint for Dachuanxiong formula.The chromatographic conditions were investigated，the proper analytical wavelength was inspected，and theprecision，reproducibility and stability were determined.Chromatographic conditions：A Hypersil ODS2 C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）was applied with the gradient elution solvent system composing of methanol（A）and 1%acetic acid water（B）：0 min→35 min，A：5%→35%；35 min→50 min，A：35%→80%；50 min→60 min，A：80%→80%；60 min→65 min，A：80%→5%.The column temperature was 30℃and the flow rate was 1 mL/min.The signal was acquired at 270 nm.Under the conditions we investigated，the precision，reproducibility and stability of the HPLC chromatographic fingerprint method were good.The HPLC chromatographic fingerprint method established in this paper applied a new method for qualitative and quantitative for Dachuanxiong formula.

Key words：Dachuanxiong formula；HPLC；fingerprint