丙烯酰胺诱导BRL-3A鼠肝细胞中环氧合酶-2表达

相启森，李世果，马云芳，董吉林，申瑞玲（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.河南省食品生产与安全协同创新中心，河南郑州450002）

丙烯酰胺诱导BRL-3A鼠肝细胞中环氧合酶-2表达

相启森1，2，李世果1，2，马云芳1，2，董吉林1，2，申瑞玲1，2
（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.河南省食品生产与安全协同创新中心，河南郑州450002）

摘要：环氧合酶-2（COX-2）在肿瘤的发生、发展和侵袭过程中发挥了重要的作用。丙烯酰胺是存在于环境和食品中的一种潜在致癌物质，但目前鲜见丙烯酰胺能否诱导正常肝细胞中COX-2表达的研究报道。本研究采用蛋白质免疫印迹检测丙烯酰胺对BRL-3A鼠正常肝细胞中COX-2表达的诱导作用，发现丙烯酰胺能够以浓度依赖和时间依赖的方式诱导BRL-3A大鼠正常肝细胞中COX-2表达，表明丙烯酰胺有可能通过诱导正常肝细胞中COX-2表达而参与肿瘤的发生和发展过程。

关键词：丙烯酰胺；BRL-3A鼠肝细胞；环氧合酶-2

丙烯酰胺（Acrylamide，ACR）是一种重要的化工原料，广泛应用于污水处理、造纸、石油开采、纺织、选矿、涂料等行业[1-2]。环境中的丙烯酰胺可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径进入人体并产生毒性作用[3]。2002年4月，瑞典国家食品管理局（National Food Administration，NFA）发现富含淀粉的食物在高温加热过程中能够产生丙烯酰胺，食品中丙烯酰胺污染成为国内外研究热点[4]。大量研究证实丙烯酰胺具有神经毒性、遗传毒性和生殖毒性等多重毒性，其潜在致癌性被广泛关注[5-8]。1994年，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）将丙烯酰胺列为人类可能致癌物（2A组）[7]。环氧合酶（Cyclooxygenase，COX）是花生四烯酸合成前列腺素过程中的重要限速酶，包括组成型COX-1和诱导型COX-2[9]。大量研究表明，COX-2在结肠癌、乳腺癌、口腔癌等肿瘤组织中高表达并在肿瘤的发生、发展和转移等过程中发挥了重要的生理功能[9-11]。哺乳动物的肝脏是丙烯酰胺等外源化学毒物作用的主要靶器官。丙烯酰胺能够通过多种机制对肝组织和肝细胞造成损伤[12-13]，并可能引发肝组织的癌变[14]。但目前鲜见丙烯酰胺能否诱导肝细胞中COX-2表达的研究报道。本研究采用蛋白质免疫印迹检测丙烯酰胺对BRL-3A鼠正常肝细胞中COX-2表达的影响，以期为揭示丙烯酰胺对肝脏的致肿瘤作用提供思路。

1　材料与方法

1.1材料

BRL-3A鼠正常肝细胞株：中国科学院上海典型培养物保藏细胞库；小牛血清和RPMI-1640培养基：美国Hyclone公司；羊抗COX-2（sc-1745）、羊抗βactin（sc-1616）抗体和驴抗羊IgG抗体（sc-1747）：美国Santa Cruz公司；丙烯酰胺（ACR）、甘氨酸、N，N'-亚甲双丙烯酰胺、N，N，N'，N'-四甲基二乙胺（TEMED）、Tris碱、溴酚蓝和过硫酸铵：美国Amresco公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）印迹膜：美国Millipore公司；总蛋白提取试剂RIPA裂解液和青霉素/链霉素溶液：碧云天生物技术研究所。

1.2主要仪器

Mini-Protean Tetra小型垂直电泳槽、PowerPacTM通用电泳仪电源、Trans-Blot SD半干转印槽和ChemiDocTMXRS化学发光成像系统：美国Bio-Rad公司；Thermo 3110型CO2培养箱：美国Thermo Scientific公司；5427R型台式高速冷冻离心机：德国Eppendof公司。

1.3细胞培养及处理

BRL-3A细胞培养于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养[15]。待细胞生长至90%融合时，用含不同浓度ACR的无血清RPMI-1640培养基培养24 h或2.5 mmol/L ACR处理不同时间。

1.4蛋白样品制备

BRL-3A细胞经ACR处理结束后，弃上清液，用冷PBS洗涤2次，加入预冷RIPA细胞裂解液，置于冰上10 min使细胞充分裂解，将细胞轻轻刮下并转移到微量离心管中，离心10 min（15 000 r/min，4℃），离心后所得上清液为细胞总蛋白。采用BCA蛋白定量分析试剂盒测定其蛋白浓度并将各样品蛋白浓度调整至相等；在各组样品中加入5×上样缓冲液，混合均匀，于100℃加热煮沸5 min使蛋白变性，混匀后进行SDSPAGE电泳[16]。

1.5COX-2表达水平检测

蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后，半干转印至PVDF膜，将膜放入含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液，于水平摇床室温封闭2 h。封闭结束后，用TBST将PVDF膜洗涤3次，每次10 min；然后将膜放入一抗孵育溶液中，4℃孵育过夜；一抗孵育结束后，将PVDF膜用TBST振摇洗涤3次，每次10 min；然后将PVDF膜放入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液中，室温缓慢摇动孵育2 h。二抗孵育结束后，将膜用TBST振摇洗涤3次，每次10 min；加ECL显色液，采用Chemi-DocTMXRS化学发光成像系统进行成像，Quantity One 4.6.2软件分析各蛋白条带的光密度值[16]。

1.6统计学分析

试验数据以平均值±标准差表示。采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理，各组间的差异比较采用独立样本t检验，以P<0.05表示差异显著，以P<0.01表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1不同浓度丙烯酰胺对BRL-3A细胞中COX-2表达的影响

分别用终浓度为1.0、2.5、5.0 mmol/L的丙烯酰胺处理BRL-3A细胞24 h，丙烯酰胺浓度对诱导COX-2表达的影响见图1。

图1　丙烯酰胺浓度对BRL-3A细胞中COX-2表达的影响Fig.1　Effects of acrylamide concentration on COX-2 expression in BRL-3A cells

如图1可知，BRL-3A细胞在正常条件下COX-2蛋白低表达。经不同浓度丙烯酰胺（1.0、2.5、5.0 mmol/L）处理24 h后，BRL-3A细胞中COX-2蛋白表达水平明显升高，并且丙烯酰胺对COX-2表达的诱导作用随其添加浓度的升高而增强。

蛋白条带的光密度定量分析结果见图2。

图2　定量分析蛋白免疫印迹条带的光密度Fig.2　Densitometric quantification of Western blot protein bands

由图2可知，2.5 mmol/L和5.0 mmol/L丙烯酰胺处理组细胞中COX-2蛋白表达水平分别与空白组存在极显著差异（P<0.01）。以上结果表明丙烯酰胺能以浓度依赖的方式诱导BRL-3A细胞中COX-2蛋白表达。

2.2丙烯酰胺处理时间对BRL-3A细胞中COX-2表达的影响

分别用丙烯酰胺（终浓度为2.5 mmol/L）处理BRL-3A细胞0、3、6、12、24 h，丙烯酰胺处理浓度对其诱导COX-2表达的影响见图3。

图3　处理时间对丙烯酰胺诱导BRL-3A细胞中COX-2表达的影响Fig.3　Effects of exposure time on acrylamide-induced COX-2 expression in BRL-3A cells

如图3所示，经丙烯酰胺（2.5 mmol/L）处理0～3 h，BRL-3A细胞中COX-2蛋白表达水平未明显升高；从6 h开始到24 h，COX-2表达水平逐步升高。

蛋白条带的光密度定量分析结果见图4。

图4　定量分析蛋白免疫印迹条带的光密度Fig.4　Densitometric quantification of Western blot protein bands

由图4可知，2.5 mmol/L丙烯酰胺处理3 h后，BRL-3A细胞中COX-2蛋白表达水平与空白组存在显著差异（P<0.05），6、12、24 h处理组COX-2蛋白表达水平与空白组存在极显著差异（P<0.01）。以上结果表明丙烯酰胺能以时间依赖的方式诱导BRL-3A细胞中COX-2蛋白的表达。

3　结论与讨论

作为花生四烯酸合成前列腺素过程中的一个重要的限速酶，COX-2在正常组织中不表达或微弱表达，但其在结肠癌、乳腺癌、口腔癌、前列腺癌等肿瘤中普遍存在过度表达的现象[9-11，17]。研究表明，COX-2可能通过促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡、诱导肿瘤血管生成、活化前致癌物等多种分子机制参与肿瘤的发生和发展过程[9，18]。作为人类可能的致癌物质，丙烯酰胺广泛存在于各种化学制品和高温加热的食品中。虽然没有确切研究表明丙烯酰胺与人类癌症发生相关，本研究证实丙烯酰胺能够以浓度依赖和时间依赖的方式诱导BRL-3A大鼠正常肝细胞中COX-2表达，表明丙烯酰胺有可能通过诱导正常细胞中COX-2表达而参与肿瘤的发生和发展过程。在今后的研究中，应采用动物试验并结合特异性COX-2抑制剂进一步明确丙烯酰胺诱导正常细胞中COX-2表达与其致肿瘤作用之间的关系，并采用细胞生物学和分子生物学方法揭示丙烯酰胺诱导COX-2表达的分子机制。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.006

收稿日期：2014-05-20

基金项目：郑州轻工业学院博士科研基金（NO.2013BSJJ079）

作者简介：相启森（1984—），男（汉），讲师，博士，研究方向：食品化学与营养。

Acrylamide Induces Cyclooxygenase-2 Expression in BRL-3A Rat Liver Cells

XIANG Qi-sen1，2，LI Shi-guo1，2，MA Yun-fang1，2，DONG Ji-lin1，2，SHEN Rui-ling1，2
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，Henan，China；2.Henan Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety，Zhengzhou 450002，Henan，China）

Abstract：Cyclooxygenase-2（COX-2）plays a key role in the development，progression，and invasion ofhuman cancer.Acrylamide is a kind of potential carcinogen，which exists widely in the environment and foods. Whether acrylamide can induce the expression of COX-2 in normal hepatocytes is not fully understood.In the present study，the effects of acrylamide on COX-2 expression in Buffalo rat liver 3A（BRL-3A）cells were investigated with western blotting analysis.The results indicated that acrylamide could induce the expression of COX-2 in a dose-and time-dependent manner，suggesting that acrylamide may participate in the development and progression of cancer through inducing COX-2 expression in normal liver cells.

Key words：acrylamide；BRL-3A rat liver cells；cyclooxygenase-2