玉米须粗多糖体外抗氧化活性研究

周鸿立，张　硕，胡乐安，张　彬（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022）

玉米须粗多糖体外抗氧化活性研究

周鸿立，张硕，胡乐安，张彬
（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022）

摘要：采用1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基、还原力4种模型研究玉米须粗多糖的抗氧化活性，试验结果表明玉米须粗多糖在浓度分别为0.1、1.0、2.0 mg/mL时对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的半抑制浓度IC50分别为0.141、1.429、2.891 mg/mL，具有一定的还原能力，存在着明显的量效关系，有进一步研究的价值。

关键词：玉米须；多糖；自由基；体外抗氧化作用

玉米须（corn silk or stigma maydis）是禾本科作物玉米（Zea mays L.）的干燥花柱和柱头，含有多种对人体有益的化学成分，如黄酮、皂苷、生物碱、多糖和有机酸等，具有多方面药理作用[1]，资源丰富、价廉易得，其多糖具有增强免疫功能、抗肿瘤、降糖、利尿、解热、利胆等作用，杜鹃[2]报道其毒性低，无法测到半数致死量（LD50），具有一定的开发价值。关于玉米须多糖提取纯化及药效学研究的比较多[3]，体外抗氧化研究的相对较少。其中梁子安等[4]研究了不含淀粉、蛋白质和核酸的玉米须纯化多糖，能明显降低老年大鼠血清MDA含量及脑和肝组织Lf含量，明显提高血清SOD，CAT，GSH-Px活性皮肤HYP含量；郭晓强等[5]分离得到2个单体多糖CSPS-1和CSPS-2，质量分数到达92.9%、95.3%，组分CSPS-1为中性糖对DPPH自由基具有轻微的清除作用，而组分CSPS-2为酸性糖对DPPH自由基生成具有促进作用，2组分单糖对邻苯三酚自氧化反应中超氧阴离子和Fenton反应中羟基自由基均有清除作用，说明不同纯度的多糖抗氧化活性有差异。目前临床应用水煎剂得到的成分主要为粗多糖，因此有必要研究玉米须粗多糖（CPCS）的体外抗氧化作用，为玉米须多糖的进一步研究和应用提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

玉米须采自吉林省吉林市郊区，经吉林大学王广树鉴定为甜黏1号，经干燥处理后备用。1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美国sigma公司进口分装；30%双氧水、邻二氮菲、三羟甲基氨基甲烷（trisbase）、邻苯三酚、抗坏血酸（VC）、三氯化铁、三氯乙酸、硫酸亚铁、无水乙醇、EDTA-2Na等试剂均为分析纯：天津市大茂化学试剂厂。

752N紫外可见分光光度计、FA2004N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；HH-S恒温水浴锅：江苏金坛市正基仪器有限公司；GZX-GW·2-BS高温干燥箱：上海博泰实验设备有限公司；PHS-3C数字式酸度计：上海理达仪器厂；LDZ-5-2低速自动平衡离心机：北京医用离心机厂；ZBP/C-YCL400P/3P超声波药品处理机：山东济宁金百特。

1.2方法

1.2.1玉米须粗多糖的提取

玉米须干燥、粉碎过40目筛，称取100 g放入5 000 mL的圆底烧瓶中，加入10倍量的水，浸泡过夜，加水至3 000 mL，90℃水浴加热30 min，提取3次，第2、3次体积减半，滤液合并，浓缩至总体积1/4～1/3，加入无水乙醇至终浓度为70%，在冰箱静止12 h，3 500 r/min离心10 min，真空干燥得玉米须粗多糖。

1.2.2玉米须粗多糖含量的测定

玉米须粗多糖含量测定采用苯酚—硫酸法[6]，以葡萄糖作为标准品，按标准曲线法计算含量。

1.2.3清除DPPH自由基能力的测定

采用鲁晓翔等[7]的方法。分别取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL不同浓度的CPCS，在517nm处检测吸光度。以0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL不同浓度梯度的VC作为阳性对照。2 mL蒸馏水加2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液所测的吸光度为Ao；同体积样品液加无水乙醇所测的吸光度为Aj；同体积样品液加0.1 mmol/L的DPPH溶液所测的吸光度为Ai。

清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

1.2.4清除羟基自由基能力的测定

采用Fenton法[8]研究。取0.75 mmol/L邻二氮菲1 mL于试管中，依次加入PBS（pH 7.40）2 mL，蒸馏水1 mL，充分混匀后，加入0.75 mmol/L硫酸亚铁1 mL，混匀，加质量分数为0.12%的双氧水1 mL，37℃水浴60 min，于536 nm处测定其吸光度Ap；用蒸馏水代替双氧水，测定其吸光度Ab；用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL不同浓度的CPCS溶液代替蒸馏水1 mL，测定其吸光度As。以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同浓度梯度的VC做阳性对照。

清除率/%=（As-Ap）/（Ab-Ap）×100

1.2.5清除超氧阴离子自由基能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法[9-10]。研究超氧阴离子自由基的清除作用。取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL不同浓度的CPCS溶液，在325 nm波长测吸光度，V1为对照管邻苯三酚的自氧化速率，△A/min；V2为样品管邻苯三酚的自氧化速率，△A/min。以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL不同浓度梯度的VC做阳性对照。计算对超氧阴离子自由基的清除率：

清除率/%=（V1-V2）/V1×100

1.2.6还原力的测定

采用戴晶晶的方法[11]。取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同浓度的CPCS 1 mL，在10 mL离心管中分别加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5 mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20 min。取出后加入2.5 mL10%三氯乙酸终止反应，5 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL三氯化铁，混匀后静置10 min，在700 nm处检测吸光值。以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL不同浓度的VC作为阳性对照，在波长700 nm条件下测定吸光度。

2　结果与分析

2.1标准曲线与多糖提取含量

回归方程为A=7.530 1C+0.008 1，r2=0.999 8，玉米须粗多糖含量为24.44%。

2.2玉米须粗多糖清除DPPH自由基能力

玉米须粗多糖清除DPPH自由基能力见图1。

图1　清除DPPH自由基能力Fig.1　Scavenging effect on DPPH

DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，被广泛应用于抗氧化剂的研究中，具有稳定、灵敏和简便等优点[12]。由图1可知，CPCS在浓度为0.10 mg/mL时对DPPH自由基的清除率达到55.9%，而VC在浓度为0.01mg/mL时为92.92%，经线性拟合计算得CPCS和VC的IC50分别为0.141 mg/mL和0.013 mg/mL。不同浓度的样品对DPPH自由基的清除能力不同，随着样品浓度的增加，对DPPH自由基清除率越高，在试验时间内呈量效关系，这表明CPCS具有清除DPPH自由基的能力，清除效果不及VC。论文[6]中多糖浓度为2.0 mg/mL时清除率达到4.158%，虽然其纯度（纯度为92.9%）很高，其清除率却不成比例，提示CPCS可能是多种抗氧化成分累加的结果，纯度不能代表抗氧化作用。另外，也应考虑该方法的主要缺陷是DPPH自由基会与其他自由基（如烷氧自由基）发生反应，且自由基反应达到稳定状态的时间与抗氧化剂和DPPH的浓度比不成线性关系[13]，应引起重视。钟耀广等[14]报道香菇多糖未脱蛋白和脱蛋白的多糖均具有抗氧化活性，均随多糖浓度的增大而增大，但未脱蛋白的抗氧化活性高于脱蛋白的多糖，进一步提示多糖的纯度与抗氧化作用之间的不一致性。

2.3羟自由基清除率的测定

玉米须粗多糖清除羟基自由基能力见图2。

图2　清除羟基自由基能力Fig.2　Scavenging effect on hydroxyl radical

由图2可知，当CPCS的浓度为1.0mg/mL时，清除率为42.21%，而相同浓度VC的清除率为45.39%，经线性拟合计算得CPCS和VC的IC50分别为1.429 mg/mL 和1.098 mg/mL。CPCS具有较强的清除羟基自由基的能力，且随着多糖质量浓度的逐渐增加，对羟基自由基的清除能力也随之增强，呈现良好的量效关系，但清除效果与VC接近。单体的多糖在浓度为2.0 mg/mL时清除率达到43.8%，与粗多糖清除率接近。这说明粗多糖的羟基基团能够提供氢电子与羟基反应，从而达到清除羟基自由基的效果，是否与杂质在此体系没有相关性或比较弱有待于进一步探讨。

2.4超氧阴离子自由基清除率的测定

玉米须粗多糖清除超氧阴离子能力见图3。

图3　清除超氧阴离子能力Fig.3　Scavenging effect on superoxide anion

由图3可知，当CPCS浓度达到2.0 mg/mL时，清除率为32.21%，而VC在浓度为0.1 mg/mL时清除率已达45.28%，增大CPCS浓度后，对超氧阴离子自由基的清除能力有增强的趋势，即呈现出量效关系。超氧阴离子自由基是所有氧自由基中的第一个自由基，可以经过一系列反应产生其他氧自由基，与许多疾病有密切联系，超氧阴离子自由基的清除对于保护机体细胞的早期氧化损伤至关重要[15]。经线性拟合计算得CPCS和VC的IC50分别为2.891 mg/mL和0.144 mg/mL，CPCS对邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子具有一定的清除作用，但清除作用较弱，论文[5]中多糖组分CSPS-1、CSPS-2在浓度为2.0mg/mL时清除率分别为47.7%、53.2%，CPCS清除率弱于单体多糖，说明CPCS中多种化学成分在这个体系中没有协同作用，表明抗氧化作用的复杂性。

2.5玉米须粗多糖的还原能力的测定

玉米须粗多糖还原力作用见图4。

图4　还原力作用Fig.4　Reducing power

从图4可知，随着多糖浓度的增加，吸光度值逐渐增大，表示样品的还原力越强[12]。在相同条件下，0.2 mg/mL VC在 700 nm处反应体系的吸光度为1.139，而1.0 mg/mL的CPCS的吸光度为0.374。这表明粗多糖可以提供电子，并与自由基结合，转化成稳定的物质，从而终止自由基的生成，具有一定的还原能力，其还原能力随着样品浓度的增大而增大，呈量效关系，但没有VC还原能力强，未见CPCS还原能力测定的相关报道。

3　结论

试验结果表明，CPCS对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基有较好的清除作用，具有一定的还原能力，且浓度与清除率在一定浓度范围内呈量效关系，但CPCS清除效果较VC弱。论文[5]中的多糖虽然纯度很高，但是在相同浓度的情况下清除DPPH自由基能力不如CPCS，究其原因，一方面可能与粗多糖中含有不同的化学成分有关：邸亚萍[16]研究发现玉米须黄酮的含量虽低但是其体内、体外的抗氧化活性都很良好；也可能是由于粗多糖中多种级份多糖的含量有关，有报道认为多糖自由基清除能力的差异可能是由于粗品多糖的自由基清除能力是多种级份多糖共同的贡献[17]。另一方面可能是因为论文[5]中用100℃、3 h提取条件提取玉米须多糖，温度高、时间长，可能引起CPCS结构的变化，从而影响了多糖的活性。

抗氧化活性的检测方法与被测物的性质、组成和监测体系等密切相关，深入了解不同抗氧化活性检测方法的原理、优缺点和它们之间的关系，以及不同条件下对样品抗氧化活性的检测能力，对于全面、真实地了解抗氧化剂的活性具有重要的意义。但体外抗氧化研究反映的是一个侧面，不足以全面了解多糖抗氧化作用。虽然CPCS抗氧化活性弱于VC，但在一定浓度范围内能够抑制自由基引起的氧化损伤，对于离体大面积筛选抗氧化药物有一定的价值。因此，还应结合其它体内外动物模型以及技术手段，进行较为全面的抗氧化作用评价，为高效利用玉米须多糖寻找新方法，也为开发高附加值玉米深加工产品提供参考。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.003

收稿日期：2014-03-06

基金项目：吉林省科技厅（20130303050NY）；吉林省教育厅（2013第319号）；吉林化工学院（2014059）

作者简介：周鸿立（1967—），女（汉），教授，博士，研究方向：从事天然产物的研究与开发。

Study on Antioxidant Activity of the Crude Polysaccharide from Corn Silk in Vitro

ZHOU Hong-li，ZHANG Shuo，HU Le-an，ZHANG Bin
（College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China）

Abstract：4 methods including 1，1-diphenyl bitter basis phenylhydrazine（DPPH）free radical，hydroxyl free radical，superoxide anion free radicals and reducing power were used to evaluate the antioxidant activity of the crude polysaccharide from corn silk in vitro.And the crude polysaccharide of concentration values of 0.1，1.0 and 2.0 mg/mL respectively scavenged DPPH free radical，hydroxyl radical and super anion radical as half maximal inhibitory concentration IC50was values of 0.141，1.429 and 2.891 mg/mL，which had some reducing power，existed obviously concentration-response relationship.It is worthy of further study.

Key words：corn silk；polysaccharide；free radicals；antioxidant effect in vitro