泛素特异性蛋白酶抑制剂及其筛选方法

季飞洋，李红蕊，陈玮琳

(浙江大学医学院 免疫学研究所，浙江 杭州 310058)



泛素特异性蛋白酶抑制剂及其筛选方法

季飞洋，李红蕊，陈玮琳Δ

(浙江大学医学院 免疫学研究所，浙江 杭州 310058)

泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific protease, USP)抑制剂通过阻断泛素特异性蛋白酶的去泛素化作用而调控靶蛋白的表达或活性，进而影响细胞的生命活动及机体抗炎、抗病毒、抗肿瘤作用。本文对已知的针对USP家族各成员的抑制剂以及目前主要的USP抑制剂筛选和鉴定方法进行了综述。

泛素；去泛素化；泛素特异性蛋白酶；抑制剂；药物筛选

泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)通过26s蛋白酶体降解泛素标记的蛋白从而调控细胞周期、转录、以及细胞信号传导在内的多种细胞生命活动。该调控过程由泛素化和去泛素化介导[1]。去泛素化是将泛素链从靶蛋白上水解下来的过程，而去泛素化酶是催化这一过程的关键分子。去泛素化酶(deubiquitinating enzyme，DUB)主要分为6个家族：泛素C 末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolases，UCH)家族、泛素特异性蛋白酶(ubiquitin specific proteases, USP)家族、卵巢癌蛋白酶(ovarian tumor proteases, OTU)家族、MJD(Josephin domain)家族、JAMM(JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme)家族和单核细胞趋化蛋白诱导蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein, MCPIP)家族。研究最广泛的USP家族和UCH家族，分别有80多个成员和4个成员[2-3]。自从bortezomib和carfilzomib 2个蛋白酶体抑制剂分别于2003年和2012年被美国FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤后，泛素-蛋白酶体系统成为一个热门的抗癌药物筛选靶点，但是由于药物的特异性以及耐药性问题，这2种药物的治疗效果并不理想[4-5]。因此，研究者将目光投向USP抑制剂，希望找到更高效、高特异性的USP抑制剂用于临床的抗肿瘤、抗感染等治疗。目前已经发现的USP抑制剂包括针对USP1、USP2、USP7/47、USP8、USP11、USP14的抑制剂以及一些非特异性的USP抑制剂。抑制剂的筛选和鉴定方法主要有：探针法、Ub-AMC(ub-7-amino-4-methylcoumarin)法、TR-FRET(time resolved fluorescence resonance energy transfer)法、Ub-PLA2(ubiquitin protein-phospholipase A2)法。但这些方法在价格、筛选速度和筛选范围上或多或少存在一些缺陷，寻找一种理想的筛选方法对USP抑制剂筛选意义重大。

1 USP抑制剂

1.1 USP1抑制剂 USP1抑制剂主要有N-苄基-2-苯基嘧啶-4-胺的衍生物ML323、Pimozide、GW7647和C527，见表1。它们在DNA的损伤修复以及抗肿瘤方面具有明确的调控作用。USP1相关因子1(USP1-associated factor 1，UAF1)是一个分子量为80 kDa的蛋白，可以与 USP1形成复合体USP1/UAF1，并提高USP1的活性。据报道[6-7]，ML323、哌咪清(Pimozide)、GW7647均为非竞争性抑制剂，特意性靶向USP1/UAF1复合体中的USP1，而对单体的USP1抑制效果不显著，如ML323对复合体的抑制能力超过单体2000倍。ML323是目前已知性能最优的USP1抑制剂，是由定量高通量筛选(quantitative high throughput screening，qHTS)出的N-(噻吩-2-亚甲基)-2-(2-(三氟甲基)苯基)喹唑啉-4-胺经过药物优化后获得，具有高效能，高特异性及可逆性[6]。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和范可尼贫血互补群D2(fanconi anemia complementation group D2，FANCD2)在DNA跨损伤合成和DNA修复中起着重要的作用[6]。Liang等[6]发现ML323通过抑制PCNA和 FANCD2的去泛素化从而增强顺铂对非小细胞肺癌和骨肉瘤的细胞毒性，并抑制同源重组和姐妹染色单体交换。

表1 USP1抑制剂Tab.1 USP1 inhibitors

C527的特异性不及ML323。DNA结合抑制子1(inhibitor of DNA-binding-1，ID1)可促进肿瘤细胞增殖，USP1通过催化ID1的去泛素化，减少了ID1蛋白酶体途径的降解。Mistry等[8]发现C527通过抑制USP1，促进ID1降解, 对一些白血病细胞系产生细胞毒性。C527的衍生物SJB2-043、SJB2-109和SJB3-019A 也是USP1抑制剂，其中SJB3-019A的抑制效能与ML323相近[7-8]。Pimozide和GW7647的特异性尚可，除此之外一些抑制效能较高的抑制剂如三氟噻吨(flupenthixol)、三氟啦嗪(trifluoperazine)、咖马林(rottlerin)的特异性并不理想[9]。

1.2 USP7/47抑制剂 USP7是DUB系统的一个重要肿瘤靶点，而进化生物学揭示USP47是DUB家族中与USP7最紧密相关的分子，故USP47也是一个肿瘤靶点，且多种USP7抑制剂对USP47亦具有抑制作用[10]。Parsons等[11]发现USP47通过调控DNA聚合酶β的去泛素化来调控DNA碱基切除修复。USP7/47抑制剂，见表2。主要有HBX 41108、HBX 19818、HBX 28258、P5091、P22077、P45204等。

HBX 41108是高效的USP7反竞争性抑制剂，并且对USP47也产生抑制作用，但特异性不强。研究发现其对组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、UCH-L1的抑制性较显著(IC50>1 μmol/L)，同时对USP5和USP8也有一定的抑制作用。HBX 41108通过抑制USP7活性来稳定p53蛋白，在p53野生型癌细胞中诱导p53依赖的细胞凋亡[12]。

HBX 19818和HBX 28258的特异性较好，其对USP7的抑制能力是对USP2、USP5、USP8、USP20等抑制效果的30倍(IC50>200 μmol/L)以上。Reverdy等[13]证实这2种抑制剂通过抑制USP7的去泛素化而促进鼠双微体基因2蛋白(murine doubleminute 2，MDM2)的降解，从而使大肠癌细胞周期被阻断在G1期。

P5091对USP7的抑制具有特异性，其对USP2、USP8 等DUB活性的影响很小[14]。由P5091优化得到的衍生物compound14则表现出更强的抑制性和特异性。compound14对细胞凋亡相关的半胱天冬酶3(caspase 3)，参与肌纤维降解的钙蛋白酶1(calpain 1)，UPS系统的20s proteasome均无抑制作用。此外compound14针对USP家族的其他分子(USP2、USP5、USP8、USP21、USP28)的IC50值均大于31.6 μmol/L[15]。

P22077、P45204也具有USP7抑制能力，其中P22077是 P5091的类似物[16-18]。人双微体基因2蛋白 (human doubleminute 2，HDM2) 作为E3泛素连接酶，通过介导p53的泛素化抑制肿瘤细胞凋亡。但HDM2极其不稳定，需要依赖USP7的去泛素化来抑制自身的降解。Fan等[19]发现P22077通过抑制USP7的去泛素化，诱导HDM2降解来稳定p53蛋白，从而促进拥有完整USP7-HDM2-p53轴的神经母细胞瘤凋亡。除此之外，P22077显著增强阿霉素和依托泊苷对神经母细胞瘤的细胞毒性。

除了人工化合物外，天然药物中也发现了USP7抑制剂。Michitaka等[20]从700多种海洋无脊椎动物提取液中筛选得到的吡咯生物碱Spongiacidin C表现出较强的USP7抑制活性。在特异性方面，Spongiacidin C对 USP2、USP8和 SENP1均无抑制，但对USP21有一定的抑制作用(IC50=16.6 μmol/L)。

表2 USP7/47抑制剂Tab.2 USP7/47 inhibitors

1.3 USP2抑制剂 国内研究者用Ub-PLA2法从天然化合物中筛选出USP2抑制剂紫菀酮(见图1)，揭示紫菀酮通过抑制USP2的底物Cyclin D1去泛素化，促进Cyclin D1降解从而抑制肿瘤细胞增殖。该研究团队还确定了紫菀酮与USP2之间最理想的结合模式[21]。虽然紫菀酮对USP2的抑制效能较低，但为后续的USP2抑制剂发展提供了先导化合物，提示从天然化合物中筛选获得USP抑制剂的可行性。

图1 紫菀酮结构图Fig.1 The structure of shionone

1.4 USP8抑制剂 Hybrigenics公司在2007年筛选出了USP8的抑制剂HBX90397、HBX90659[16,22]。此后，2010年Matteo等[23]通过研究USP7和USP8的抑制剂发现compound(5k、22b、22c、22d、22e、22f)有很强的USP8抑制活性(IC50值均小于1 μmol/L)，且远大于对USP7的抑制活性(其中22b-f的IC50均大于100 μmol/L)，但这6种抑制剂对USP家族其他成员的抑制活性尚未确定。

1.5 USP11抑制剂 USP11与DNA损伤修复蛋白BRCA2(breast cancer 2)相互作用，在DNA双链断裂修复中起重要作用，促进癌细胞的存活。Richard等[24]从美国食品与药品管理局提供的2000多种化合物中筛选出6种USP11抑制剂，并发现6种药物中的Mitoxantrone(见图2)。能明显遏制胰腺导管腺癌细胞的存活，但他们未检测这6种USP11抑制剂的特异性。

图2 Mitoxantrone结构图Fig.2 The structure of Mitoxantrone

1.6 USP14抑制剂 IU1(1-[1-(4-fluorophenyl)-2,5-dimethylpyrrol-3-yl]-2-pyrrolidin-1-ylethanone)，见图3。它是目前已知的效果最显著的USP14抑制剂，特异性强，对USP2、USP7等8种DUB均无抑制活性[25]。USP14能抑制蛋白酶体的活性，从而降低泛素化蛋白的降解，多种病毒在进入细胞后通过抑制细胞蛋白酶体的活性保护自身蛋白不被降解。Dilip等[26]发现IU1通过促进蛋白酶体活性来抑制登革热病毒复制。Chen等[27]发现另一种USP14抑制剂Auranofin通过选择性抑制USP14和UCHL5从而对伊马替尼耐药性的慢性粒细胞白血病有治疗效果。

图3 IU1结构图Fig.3 The structure of IU1

1.7 非选择性USP抑制剂 Curcusone D(见图4)能够抑制USP5、USP7、USP8、USP13、USP14、USP15、USP22, 但是对UCH-L1、UCH-L3、UCH-37 活性无影响。Cao等[28]发现其能与硼替佐米协同作用治疗多发性骨髓瘤。

查耳酮衍生物AM146、RA-9 和RA-14均表现出对UCHL1、UCH-L3、USP2、USP5、USP8的直接抑制，但是对USP7、USP14等的活性无明显影响。Issaenko等[29]研究发现这3种化合物可以通过影响蛋白质泛素化过程，上调P53、P27和P16水平来抑制肿瘤细胞增殖。

PR619(见图4)对DUBs中的USP2、USP4、USP5、USP7、USP8等都有可逆的抑制作用[17-18]。Veronika等[30]发现PR619通过抑制去泛素化酶的活性对微管网络产生调控作用并阻止蛋白质堆积从而改善神经退行性疾病。

WP1130(见图4)的特异性较差，对USP5、USP9X、UCH-L5等都有抑制作用[16]。

图4 非选择性USP抑制剂结构图Fig.4 The structure of nonselective USP inhibitors

2 USP抑制剂筛选及鉴定方法

2.1 探针法 探针法利用细胞自身产生的DUB分子对泛素链的识别来筛选和鉴定抑制剂。该方法首先将细胞与备选抑制剂共孵育，之后将细胞抽提物与HA-Ub探针共孵育，通过免疫共沉淀收集与HA-Ub探针结合的有活性的DUB分子，最后通过凝胶电泳或质谱定性定量活性DUB分子。该方法的优点是不需要购买众多的DUB试剂便能筛选全DUBs的抑制剂，且接近细胞生理状态；缺点是费时费力，所以目前并不推荐用于筛选USP抑制剂，而主要用于对已有USP抑制剂的特异性鉴定[17]。

2.2 Ub-AMC法 Ub-AMC法是目前最适合大规模USP抑制剂筛选的方法， 大部分USP抑制剂都由该方法筛选获得。荧光底物AMC与泛素链结合不发射荧光，当USP将荧光底物AMC从泛素链上切割下来后，AMC发射荧光，通过检测荧光强度分析USP的抑制程度。不同USP分子的荧光底物不同，目前商品化的荧光底物有USP7的Ub-EKL、USP2的IQF K4804、USP8和USP21的Ub-Rh110等。Ub-AMC法的优势是对UCH家族的4种去泛素化酶同样敏感，单次检测费用低，且已商品化。其主要缺点是激发波长在340nm的紫外区，不是一个较好的药物筛选波长，且目前很多USP分子还未有对应底物。

2.3 TR-FRET法 TR-FRET法利用荧光能量共振转移的原理，泛素链的N末端接上YFP，C末端接上terbium标记的半胱氨酸残基，USP分子将泛素链C末端的半胱氨酸残基切除后荧光信号强度降低。TR-FRET法的优点是对UCH家族的4种去泛素化酶同样敏感，其对于无关化合物的抗干扰能力强于Ub-AMC法。但目前为止TR-FRET法还没有商品化的试剂盒，且很多USP分子还没有对应底物。罕有报道使用该方法筛选USP抑制剂。

2.4 Ub-PLA2法 Ub-PLA2法的原理与Ub-AMC法类似，主要的不同之处在于PLA2从泛素链上切割下来后不直接发射荧光，而是作用于荧光底物并使其发射荧光。Nicholson B等[31]发现同一Ub-PLA2底物对USP2、USP5、USP7、USP8等均有良好的底物活性。该方法的优点在于USP底物更接近生理状态，信号强度和持续时间优于Ub-AMC法，且激发波长不在紫外区，目前也有商品化的试剂盒。但Ub-PLA2法对UCH家族的4种去泛素化酶不敏感，且其单次检测的价格高于Ub-AMC法。目前利用该方法筛选出的USP抑制剂有紫菀酮、P22077等[32]。

3 结语

USP作为抗肿瘤、抗病毒、抗感染等的良好药物靶点是目前研究的热点，但是以USP作为靶点的抑制剂由于效能太低，绝大多数抑制剂IC50在 μmol级别，特异性亦不够理想，目前临床上还没有被正式批准的特异性USP抑制剂。USP抑制剂的筛选与研究正处于起步阶段，需要更多的研究成本投入；目前的药物筛选方法也需要进一步优化，以便开发多种USP分子的合适底物。除此之外，组合化学及合成药物的开发越来越困难，大规模的筛选所需设备等要求较高。因此，天然药物的开发以及已有药物的重新利用成为一个新的研究方向，且可用于筛选的天然药物种类有限，无需大规模的高通量筛选，已有的Ub-PLA2试剂盒即可满足要求，可被大多数实验室接受。一种可行的天然药物筛选方法是将探针法的细胞培养与Ub-PLA2法的底物荧光反应相结合。综合考虑时间、灵敏度、特异性等进行新型USP抑制剂的有效筛选。

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(编校：王冬梅)

USP inhibitors and screening methods

JI Fei-yang, LI Hong-rui, CHEN Wei-linΔ

(Institute of Immunology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310058, China)

The ubiquitin-specific protease (USP) inhibitors influence many crucial cellular activities and some immune processes, such as anti-inflammatory, anti-infection and anti-tumor by silencing the functions of USP.The main USP inhibitors, which potency and specificity are underlined and current methods for detecting and identifying USP inhibitors are discussed of in this review.

ubiquitin; deubiquitination; ubiquitin-specific protease; inhibitor; drug screening

国家自然科学基金 (81322042)；中央高校基本科研业务费专项资金(2014XZZX003-33)；国家理科基础科学研究和教学人才培养基地研究基金(J1103603)

季飞洋，男，本科，研究方向：抗病毒感染免疫研究，E-mail：3110103638@zju.edu.cn；陈玮琳，通讯作者，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：感染免疫和肿瘤免疫研究，E-mail：cwl@zju.edu.cn。

TQ460.31；R914.2

A

1005-1678(2015)07-0152-05