白芍总苷通过下调TLR4/NF-κB/TGF-β1信号通路改善阿霉素肾病大鼠肾纤维化

朱亚利，关凤军，安娜，白沙沙，杨珊珊

(徐州医学院附属医院 儿科，江苏 徐州 221002)



白芍总苷通过下调TLR4/NF-κB/TGF-β1信号通路改善阿霉素肾病大鼠肾纤维化

朱亚利，关凤军，安娜，白沙沙，杨珊珊

(徐州医学院附属医院 儿科，江苏 徐州 221002)

目的 探讨白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)对阿霉素肾病大鼠肾组织纤维化的影响及其机制。方法 30只健康雄性SD大鼠尾静脉注射阿霉素制备模型，成模后随机分为模型对照组(ADRN组)和白芍总苷干预组(TGP组)，同时设立正常对照组(CON组)；干预8周后ELISA法检测血清Cr、BUN；尿蛋白定量法测24 h尿蛋白；Masson染色观察肾脏纤维化程度；RT-PCR法检测肾组织TLR4/NF-κB/TGF-β1mRNA表达；免疫组化法检测肾组织TLR4/NF-κB/TGF-β1蛋白含量。结果 与CON组相比，ADRN组大鼠血清Cr、BUN、24 h尿蛋白水平升高(P<0.01)，肾组织纤维化程度加重(P<0.01)，TLR4/NF-κB/TGF-β1表达升高(P<0.05)；与ADRN相比，TGP组大鼠Cr、BUN、24 h尿蛋白水平下降(P<0.01)，肾组织纤维化程度减轻(P<0.01)，TLR4/NF-κB/TGF-β1表达下降(P<0.05)。结论 TGP可以改善阿霉素肾病大鼠的肾脏功能，减轻病理损伤，其机制可能与下调TLR4/NF-κB/TGF-β1通路进而改善阿霉素大鼠肾纤维化有关。

白芍总苷；TLR4/NF-κB/TGF-β1信号通路；阿霉素大鼠；肾纤维化

原发性肾病综合征(Primary nephrotic syndrome, PNS)为儿童常见的肾脏疾病，其中微小病变肾病及局灶节段性肾小球硬化分别占儿童原发性肾病综合征的80%～90%与5%～10%[1-2]。目前，阿霉素肾病(adriamycin-induced nephropathy，ADRN)模型是国内外公认的能较好模拟人类微小病变及局灶节段性肾小球综合征的动物模型，其临床表现为大量蛋白尿，低蛋白血症，高脂血症等[3-4]，除此之外，阿霉素肾病大鼠肾小球及肾小管内有纤维蛋白原的出现，并随时间的变化而持续增加，可出现肾脏纤维化[5-6]。

近几年改善肾组织纤维化的辅助治疗的研究多集中在中药领域，其中白芍总苷的相关研究较为广泛，白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)是白芍干燥根的提取物，主要成分为芍药苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等[7]。已有实验证实TGP可治疗系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系膜型肾炎及免疫性肝损伤。然而TGP对阿霉素肾病大鼠肾纤维化的影响鲜见报道，本实验通过阿霉素诱导的大鼠肾纤维化模型，观察TGP对阿霉素肾病大鼠肾纤维化的影响，并探讨其减轻纤维化的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 健康SD大鼠30只，雄性，体质量(180±20)g，由徐州医学院实验动物中心 [SYXK(苏)2010-0011] 提供；阿霉素(浙江海正药业股份有限公司，批号：130702)；白芍总苷(宁波立华制药有限公司，批号：150107)；尿蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20150113)；大鼠肌酐、尿素氮Elisa试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司，批号：201503)；Masson三色染色液(上海源叶生物科技有限公司)；TLR4、NF-κB、TGF-β1及β-actin引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；超敏兔两步法检测试剂盒(北京中杉金桥，批号：K153317B)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥，批号：K1553317E)；兔抗TLR4多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司，批号：217847)；兔抗NF-κB多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司，批号：ZP1310BP10)；兔抗TGF-β1多克隆抗体(Abcom，批号：GR148954-1)；BX43F型正置荧光显微镜(日本Olympus公司)；GL2200Pro型凝胶成像系统(美国Carestream公司)。

1.2 实验动物分组及给药 实验前大鼠适应性饲养1周，随机分为正常对照组(CON组，8只)和造模组(22只)，造模组[8]按4 mg/kg尾静脉注射阿霉素浓度为2 mg/mL，注射体积为0.32～0.40mL，间隔一周后，再次尾静脉注射阿霉素4 mg/kg，正常对照组注射等量生理盐水。饲养8周后，收集24 h尿液，以24 h尿蛋白含量大于100 mg为造模成功标准，阿霉素肾病大鼠成模16只，分为阿霉素肾病模型组(ADRN组，8只)及白芍总苷组(TGP组，8只)。白芍总苷组给予TGP 100 mg/kg灌胃，浓度为10 mg/mL,给药体积为1.9～2.5 mL。每天1次，CON组及ADRN组给予等体积生理盐水灌胃，共8周。8周后每组老鼠均剩余6只，收集尿液、血、肾组织进行检测。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 肾功能生化指标检测：尿蛋白定量试剂盒检测24 h尿蛋白含量，大鼠肌酐、尿素氮Elisa试剂盒检测Cr、BUN含量，操作按照说明书进行。

1.3.2 肾组织Masson染色：取肾组织，用4%多聚甲醛进行固定，常规石蜡包埋，制作切片，连续切片(厚4 μm)，每5张取1张，每个标本取3张切片。脱蜡后行Masson染色，光镜下观察细胞呈红色，胶原纤维呈蓝绿色，每张切片在200倍光学显微镜下观察并随机选取4个视野拍照，用Image-Pro Plus 5.0 图像处理系统测量胶原纤维阳性区占所观察视野的面积比。

1.3.3 RT-PCR法检测肾组织TLR4/NF-κB/TGF-β1mRNA表达 于-80 ℃ 冰箱取出肾组织，按Trizol试剂说明书方法提取肾组织总RNA。取1 μg进行RT-PCR反应。所用 RT-PCR扩增引物设计如下：TGF-β1正向引物序列为：5’- ATGTGCAGGATAATTGCTGCC -3’， 反向引物序列为：5’-TGGTGTTGTACAGGCTGAGG-3’， 产物长度为182bp。 NF-κB正向引物序列为：5′-TGCGAATGGAGCGACAGG-3′，反向引物序列为：5′-AGGCCAAATGAAAGGAGTGG-3′，产物长度为243bp。TLR4正向引物序列为：5’- CCAGAGCCGTTGGTGTAT-3’，反向引物序列为：5’-GCCCTGTGAGGTCGTTGA-3’，产物长度为419bp。β-actin正向引物序列为：5’-TCAGGTCATCACTATC-GGCAAT-3’，反向引物序列为：5’-AAAGAAAGGGTGTAAAA-CGCA-3’，产物长度为432bp。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，用GL2200Pro型凝胶成像系统对每一标本的PCR产物扩增的特异性片段进行灰度扫描，用TLR4、NF-κB及TGF-β1的灰度值与β-actin的比值表示目的基因TLR4、NF-κB及TGF-β1的相对表达量。

1.3.4 免疫组化法检测肾组织TLR4/NF-κB/TGF-β1蛋白含量：取肾组织常规石蜡包块制作切片，连续切片(厚4 μm)，每5张取1张，每个标本取3张切片。采用免疫组织化学法检测TLR4、NF-κB及TGF-β1蛋白含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。抗体按1:200的方法稀释，以PBS替代一抗作为阴性对照，将切片置于200倍光学显微镜下观察并随机选取4个视野拍照，阳性区出现棕黄色颗粒，用Image-Pro Plus 5.0 图像处理系统测量TLR4、NF-κB及TGF-β1蛋白的平均积分吸光度。

2 结果

2.1 肾功能指标 与CON组相比，ADRN组大鼠的Cr、BUN、24 h尿蛋白升高(均P<0.01)，提示阿霉素肾病造模成功。与ADRN组相比，TGP组的Cr、BUN、24h 尿蛋白有所下降(均P<0.01)，表明TGP可改善阿霉素肾病大鼠的肾脏功能，见表2。

表2 TGP对阿霉素大鼠肾功能生化指标的影响Tab.2 Effects of TGP on renal function of adriamycin-induced nephropathy ±s, n=6)

**P<0.01，与CON组比较，compared with CON group；##P<0.01，与ADRN组比较， compared with ADRN group

2.2 肾组织Masson染色 各组肾脏组织Masson染色，见图1。CON组大鼠肾组织可见少许胶原纤维沉积。ADRN组大鼠的胶原纤维沉积更加明显。TGP组胶原沉积有所减轻。用Image-Pro Plus 5.0 图像处理系统测量胶原纤维阳性区占所观察视野的面积比。结果发现，胶原纤维阳性区占所观察视野的面积比依次为CON组：0.008±0.001，ARDN组：0.11±0.02，TGP组：0.04±0.02。与CON组相比，ADRN组大鼠肾脏组织胶原纤维显著增多(P<0.01)；与ADRN比，TGP组大鼠胶原纤维显著减少(P<0.01)。

图1 TGP对阿霉素肾病大鼠肾纤维化的作用(×200，n=6)**P<0.01，与CON组比较；## P<0.01，与ADRN组比较Fig.1 Effects of TGP on renal fibrosis in adriamycin-induced nephropathy rats (×200，n=6)**P<0.01， compared with CON group；## P<0.01，与ADRN组比较， compared with ADRN group

2.3 肾脏RT-PCR结果 各组TLR4 mRNA的相对灰度值分别为CON组：0.06±0.01，ARDN组：0.21±0.01，TGP组：0.17±0.03；各组NF-κB mRNA的相对灰度值分别为CON组：0.08±0.03，ARDN组：0.28±0.02，TGP组：0.15±0.02；各组TGF-β1mRNA的相对灰度值分别为CON组：0.07±0.03，ARDN组：0.40±0.03，TGP组：0.16±0.01。与CON组相比，ADRN组大鼠肾组织TLR4、NF-κB、TGF-β1mRNA表达均显著升高(均P<0.01)；与ADRN相比较，TGP组大鼠肾组织TLR4、NF-κB、TGF-β1mRNA表达均显著降低(P<0.05)，说明TGP有抑制TLR4/NF-κB/TGF-β1mRNA表达的作用，见图2。

图2 TGP对阿霉素肾病大鼠TLR4/NF-κB/TGF-β1 mRNA表达的影响(n=6)**P<0.01，与CON组比较；#P<0.05,## P<0.01，与ADRN组比较Fig.2 Effects of TGP on expressions of TLR4/NF-κB/TGF-β1 mRNA in adriamycin-induced nephropathy rats(n=6)**P<0.01， compared with CON group；#P<0.05，## P<0.01， compared with ADRN group

2.4 肾脏免疫组化结果 CON组大鼠肾组织TLR4/NF-κB/TGF-β1低表达，阳性颗粒散在，染色较浅；ADRN组高表达，棕黄色信号强，融合成片，而TGP组表达显著降低，如图3，用Image-Pro Plus 5.0 图像处理系统分别测量每张切片的平均积分吸光度，各组TLR4蛋白的平均积分吸光度依次为CON组：0.07±0.01，ADRN组：0.17±0.04，TGP组：0.09±0.02；各组NF-κB蛋白的平均积分吸光度依次为CON组：0.06±0.02，ADRN组：0.37±0.03，TGP组：0.11±0.01；各组TGF-β1蛋白的平均积分吸光度依次为CON组：0.10±0.02，ADRN组：0.40±0.04，TGP组：0.23±0.02。与CON组相比，TLR4、NF-κB、TGF-β1的表达在ADRN组中明显升高(P<0.05)；与ADRN组相比，TGP组的TLR4、NF-κB、TGF-β1表达显著降低(P<0.05)。

图3 TGP对阿霉素肾病大鼠TLR4/NF-κB/TGF-β1 蛋白表达的影响(n=6)*P<0.05,**P<0.01，与CON组比较；#P<0.05,##P<0.01，与ADRN组比较Fig. 3 Effects of TGP on expressions of TLR4/NF-κB/TGF-β1 of adriamycin-induced nephropathy rats(n=6)*P<0.05,**P<0.01， compared with CON group；#P<0.05,##P<0.01， compared with ADRN group

3 讨论

Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是一类I型跨膜糖蛋白模式识别受体，可识别多种细胞内外病原体相关分子模式和损伤相关分子模式，活化的TLRs可激活转录因子，调节促炎性因子表达，参与固有免疫等[9-12]。其中，TLR4可与配体纤维蛋白原结合后活化，并通过髓分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依赖及MyD88非依赖的信号通路来激活核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)，NF-κB是转录因子家族的重要成员，其活化后发生核转位[13]，由胞浆转移至胞核[6]，参与转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)的合成[14]。TGF-β1是一种多功能细胞因子，通过自分泌和旁分泌来发挥其多功能的调节作用，具有促进肾组织细胞外基质(extracellular matrix, ECM)聚集的作用[15-16]。它除了可上调胶原蛋白mRNA的表达，促使胶原组织合成增加外，还能通过下调基质金属蛋白酶(MMPs)的表达以及促进纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的合成来减少ECM的降解，进而介导肾纤维化的发生[17-18]。

研究发现，白芍总苷抗肝纤维化的主要机制之一，可能是通过抑制纤维化大鼠肝组织NF-κB和TGF-β1的表达而发挥作用[19]。本研究基于白芍总苷广泛的抗炎、免疫调节、抗氧化等药理作用，探讨其改善肾组织纤维化的相关机制。在本实验中，Masson染色示阿霉素肾病大鼠出现肾纤维化，肾脏组织中TLR4/NF-κB/TGF-β1mRNA及蛋白表达明显增强，提示阿霉素肾病大鼠肾纤维化的发生可能是TLR4/NF-κB/TGF-β1信号通路的过度活化；白芍总苷干预组的肾纤维化有所改善，并且TLR4/NF-κB/TGF-β1通路的表达下调，提示白芍总苷可通过下调TLR4/NF-κB/TGF-β1通路改善阿霉素大鼠肾纤维化，下一步本课题组将在细胞水平运用基因敲除技术对相关机制进行详细探讨。

综上所述，TGP可以改善阿霉素大鼠的肾脏功能，其机制可能与下调TLR4/NF-κB/TGF-β1通路进而改善阿霉素大鼠肾纤维化有关。

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(编校：谭玲)

Total glucosides of paeony inhibits adriamycin-induced nephropathy in rats through blocking TLR4/NF-κB/TGF-β1signaling

ZHU Ya-li, GUAN Feng-jun, AN Na, BAI Sha-sha, YANG Shan-shan

(Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)

ObjectiveTo study effect and its possible mechanism of total glucosides of paeony (TGP) on adriamycin-induced nephropathy rats.MethodsThirty male SD rats were randomly divided into normal group (CON), adriamycin-induced nephropathy group (ADRN) and TGP-treated ADRN group (TGP).The rat nephropathy model was established by adriamycin injection.At the end of the 8thweek after treatment, ELISA was used to detect the level of Cr and BUN.The values of 24 urine protein was determined by urinary protein kit.Masson staining was used to observe the fibrosis.RT-PCR was used to detect the mRNA levels of TLR4/NF-κB/TGF-β1.Immunohistochemical method was used to detect the content of TLR4/NF-κB/TGF-β1.ResultsCompared with the CON group, the level of Cr, BUN, 24 urine protein of ADRN group rised(P<0.01), the degree of fibrosis of ADRN group were aggravated(P<0.01), and the expressions of TLR4/NF-κB/TGF-β1of ADRN group increased significantly.However, compared with ADRN group, the(P<0.01) level of Cr, BUN, 24 urine protein of TGP-treated rats reduced(P<0.01), the degree of fibrosis of TGP-treated rats eased(P<0.05), and the expressions of TLR4/NF-κB/TGF-β1of TGP-treated rats decreased significantly.ConclusionTGP retards the process of fibrosis and reduces the pathological damage in adriamycin-induced rats by down-regulating the expression of TLR4/NF-κB/TGF-β1signaling.

total glucosides of paeony; TLR4/NF-κB/TGF-β1signaling; adriamycin-induced nephropathy rats; fibrosis

朱亚利，女，硕士，研究方向：儿科肾脏方向，E-mail：zhuyali0105@126.com；关凤军，通讯作者，女，博士，副主任医师，研究方向：儿科肾脏方向，E-mail：guanxiaomu@sina.com。

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1005-1678(2015)07-0043-04