姜黄素调控Notch1信号通路诱导结肠癌SW480细胞株凋亡

刘少琼，杨 芳，禹正杨，李春花，刘 娅，刘婉莹

（南华大学附属第一医院，湖南 衡阳 421001）

姜黄素调控Notch1信号通路诱导结肠癌SW480细胞株凋亡

刘少琼，杨 芳，禹正杨，李春花，刘 娅，刘婉莹

（南华大学附属第一医院，湖南 衡阳 421001）

目的 从Notch1信号通路探讨姜黄素诱导结肠癌SW480细胞株凋亡的分子机制。方法 （1）利用流式细胞技术检测不同浓度姜黄素（0，7.5，15，30，60 μmol/L）处理结肠癌SW480株24 h和48 h后的细胞凋亡情况。（2）通过RT-PCR检测不同浓度姜黄素（0，7.5，15，30，60 μmol/L）处理结肠癌SW480细胞株24 h和48 h后，Notch1信号通路中膜受体基因Notch1及下游靶基因Hes-1 mRNA表达情况，观察姜黄素对Notch1信号通路中Notch1及Hes-1基因mRNA表达的影响。结果 （1）姜黄素能诱导结肠癌SW480细胞株凋亡；（2）姜黄素能一定程度上下调Notch1信号通路中Notch1及Hes-1基因mRNA的表达（P＜0.05）。结论 姜黄素能一定程度上诱导结肠癌SW480细胞株凋亡，这种对结肠癌SW480细胞毒性作用可能与调控Notch1信号通路中膜受体基因Notch1及下游靶基因Hes-1转录有关。

姜黄素；Notch1信号通路；结肠癌；SW480；细胞凋亡

肿瘤是当今世界第二大致死因素[1]，而结直肠癌是世界上第三常见恶性肿瘤，发病率在男性和女性患者中分别位居第三位和第二位[2]，并且结直肠癌在年轻人中发生率逐渐上升，年龄小于30周岁的年轻患者结直肠癌侵袭力更强、预后更差[3]。虽然，经规范联合化疗，可使结直肠癌病人5年生存率达42.7%，但世界上平均每年仍有60.8万癌症病人死于结直肠癌[4]；同时放化疗给结直肠癌患者带来明显的毒副作用，严重影响了患者的生活质量，患者依从性差，因此寻找高效、低副作用的抗肿瘤药物依然是研究者们的主攻课题。

传统中医药在亚洲地区应用于治疗恶性肿瘤有着悠久的历史。姜黄素是由中药姜黄根茎提取，目前研究显示姜黄素对包括结直肠的多种肿瘤有抑制作用，此外它还具备抗炎、抗氧化、防衰老等作用，除了功效多外，其毒副作用小、耐受性好，是极具潜力的抗癌活性物质之一[5]，然而姜黄素抗结肠癌的分子机制尚未统一，因此有必要进一步探讨。

Notch1信号通路在多种肿瘤（包括乳腺癌、肾癌、食管癌、前列腺癌及结直肠癌等）组织中检测出过度表达，并且Notch1信号与这些肿瘤对化疗药物耐药及肿瘤向周围侵袭转移相关[6-7]。Notch1信号通路在研究治疗肿瘤分子机制中占有重要地位。

本文拟从Notch1信号通路探讨中药提取物姜黄素诱导结肠癌SW480细胞株凋亡的分子机制。

1 材料

1.1 细胞株、药物与试剂

结肠癌SW480细胞株购于湘雅细胞中心 （中国，湖南长沙），无噬菌体胎牛血清购于四季青生物公司，RPMI-1640培养基购于Hyclone（美国），姜黄素粉末（J-007）购于成都瑞芬思生物科技有限公司（HPLC≥98.5%），cDNA逆转录试剂盒购于Thermo公司，DNA marker、2×Taq MasterMi（含染料）购于北京康为世纪生物科技有限公司，GoldView I型核酸染色剂均购于北京Solarbio公司，PBS粉末、总RNA提取试剂盒、流式细胞检测试剂盒购于南京凯基生物公司，cDNA扩增引物由上海生工公司设计合成。

1.2 主要仪器

AIR-TECH医用净化工作台 （苏州苏洁净化设备公司）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；PCR扩增仪（德国Roche Diagnostics公司）；Hema凝胶图像分析仪（珠海黑马医学仪器有限公司）；紫外分光光度计 （德国Eppendorf公司）；流式细胞仪 （美国BD FACSAria II）。

2 方法

2.1 细胞培养

含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，加1%青-链霉素双抗，于5%CO2，37℃孵育箱中常规培养结肠癌SW480细胞株，1～2 d换液1次；待其贴壁生长融合至80%左右、细胞处于对数生长期时进行细胞传代及种板。

2.2 药物配制及实验分组

姜黄素粉末溶于二甲基亚砜（DMSO），母液浓度为1 mol/mL，经0.22 μm无菌过滤器过滤后4℃冰箱避光保存，使用时用培养基稀释成工作液，并使DMSO最终浓度＜0.01%。

实验分组:根据浓度梯度姜黄素分为5组，即0（对照组）、7.5、15、30、60 μmol/L。处理时间:24 h和48 h。

2.3 流式细胞技术检测SW480细胞凋亡

按照凯基Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作:将对数生长期细胞根据实验分组加入含姜黄素培养基，处理24 h和48 h后分别收集细胞。用PBS洗涤细胞2次后分别加入500 μL的Binding Buffer液悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC溶液混匀后，加入5 μL碘化丙啶 （PI)，混匀；室温、避光、反应5 min；使用美国BD FACSAria II流式细胞仪检测。

2.4 RNA提取、逆转录及RT-PCR

2.4.1 总RNA提取步骤 对数生长期细胞经姜黄素处理分别24 h和48 h后，弃掉培养液，按照Solarbio总RNA提取试剂盒说明书操作提取总RNA，操作过程中均使用去酶的EP管和Tip头，RNA提取后用紫外光分光光度计进行定量，测定样品在260 nm和280 nm的吸光度，确定RNA质量。提取的总RNA进行逆转录。

2.4.2 逆转录及PCR引物扩增 按照Thermo逆转录试剂盒说明步骤进行逆转录。PCR引物扩增反应条件:95℃ 5min预变性，95℃变性30 s，按各自退火温度退火30 s，延伸 72℃ 30 s，重复循环32次，最后延伸72℃ 5 min。

扩增引物序列见表1。

表1 PCR 31物扩增引物序列及反应条件

2.4.3 琼脂糖凝胶电泳 称取2 g琼脂糖，移入三角瓶中加入1×TBE，置微波炉中加热至溶液沸腾，自然冷却至70～80℃时，加入EB替代物GoldView I型核酸染色剂，摇匀倒入模具中自然冷却制成2%琼脂糖凝胶，目的基因使用2%琼脂糖凝胶，而内参β-actin使用1%琼脂糖凝胶。制好的凝胶放入电泳槽中加入 1×TBE电泳液，每孔上样 5 μL，DNAMarker加入5 μL，80 V恒压电泳25 min，紫外灯下观察结果。

2.5 统计方法

使用AlphaImager 2200图像分析软件对存入计算机的PCR产物电泳的图像进行光密度扫描，目的基因产物光密度值/β-actin产物的光密度值为目的基因相对表达量（重复实验3次）。所得实验数据应用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据以采用One-Way ANOVA单因素方差分析法检验，结果以“±s”表示，P＜0.05代表差异有统计学意义。

3 结果

3.1 流式细胞技术检测结肠癌SW480细胞株凋亡

流式细胞结果显示姜黄素能诱导结肠癌SW480细胞株凋亡，当姜黄素浓度组为7.5 μmol/L和15 μmol/L时，与对照组0 μmol/L相比处于凋亡期细胞比例相差不大，而姜黄素浓度为60 μmol/L时，细胞处理 24 h位于Q2期细胞 （凋亡期）为56%，而处理48 h凋亡细胞可达94.4%。

3.2RT-RCR结果

当处理24 h时，姜黄素各浓度组Notch1基因mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05），而处理48 h时，60 μmol/L组与对照组 （0 μmol/L）相比，Notch1基因mRNA表达显著降低（P＜0.05）（图1，图2）。当处理 24 h时，姜黄素各浓度组 Hes-1基因mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05），而处理48 h时，60 μmol/L组与对照组 （0 μmol/L）相比，Hes-1基因mRNA表达显著降低（P＜0.05）（图3，图4）。姜黄素能一定程度上下调Notch1及Hes-1基因mRNA表达。

4 讨论

结直肠癌是世界第三大常见肿瘤，其发生发展是由遗传和生理改变多种因素共同作用而成，其主要分子机制尚未明确。在哺乳动物中，Notch信号主要由配体 （Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1、Jagged2)，受体（Notch 1-4）和相关靶基因:Hes和HERP等构成。Notch信号激活由临近细胞配-受体结合后，受体蛋白水解，释放胞浆内活性结构域（Notch intracellular domain，NICD），NICD易位至细胞核，与核内转录因子结合，诱导Notch信号下游靶基因表达和转录[8]。

图1 Notch1基因mRNA凝胶电泳图

图2 姜黄素对Notch1基因mRNA表达的影响

图3 Hes-1基因mRNA凝胶电泳图

图4 姜黄素对Hes-1基因mRNA表达的影响

Notch1信号通路是Notch信号通路之一，它能在结直肠肿瘤组织中高表达并在结直肠癌发展过程中起致癌作用，不仅如此，Notch1在组织中高表达与病人总生存期短及预后差有关，可作为判断预后和治疗结直肠癌的潜力生物标记[9]。Hes-1基因是碱性螺旋—环—螺旋 （basic Helix-Loop-Helix，bHLH）基因家族的一个重要成员，Hes-1蛋白是bHLH基因的负性转录因子，通过与靶DNA或其他一些bHLH蛋白直接结合，切断激活途径，最终使转录无法进行，达到抑制细胞分化的目的。Hes-1蛋白作为Notch信号通路下游最重要的效应分子，在细胞的分化中具有重要的作用[10]。

姜黄素是中药姜黄中提取的活性成分，临床研究显示它可作其他化疗药物（如紫杉醇、5-FU）的辅助用药，不仅增强了抗癌效果、减少化疗药物的使用剂量[11]，而且还可减轻化疗带来的毒副作用，如皮肤损伤、肠道反应等[12]。并且姜黄素无明显副作用，患者耐受性好。虽然较低的生物利用度一定程度上限制了姜黄素推广使用，但经过研究者们的努力，通过改变其剂型或者通过结合一些金属离子及特异性抗体形成杂交概念的姜黄素分子等，提高了它的生物溶解度及生物利用度[13]。

流式细胞结果显示姜黄素能一定程度上诱导结肠癌SW480细胞株凋亡。RT-PCR方法检测到姜黄素能一定程度下调结肠癌SW480细胞株中细胞膜受体基因Notch1及下游靶基因Hes-1的mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究团队前期研究显示姜黄素能够一定程度上抑制结肠癌SW480细胞株中与Notch1信号通路相关蛋白，如Notch1受体蛋白和下游靶蛋白Hes-1的表达[14-15]，从蛋白翻译水平阐述姜黄素对Notch1信号通路的调节作用，本文从基因转录水平对姜黄素调控Notch1信号通路进行补充。Notch1信号通路在人结直肠癌组织中起致癌作用，姜黄素能下调Notch1信号通路而诱导结肠癌SW480细胞株凋亡，但是Notch1信号通路是由多个元件构成，其下游有多个靶基因，并且靶基因之间关系复杂，本研究仅从Hes-1单个靶基因进行探讨姜黄素对Notch1信号通路调节作用有一定的局限性，我们期望在后续研究中找到姜黄素调控Notch1信号通路的最终靶位基因，并深入探讨其与Hes-1靶基因之间的关系。

同时姜黄素诱导结肠癌细胞株凋亡并不是通过单一分子机制完成的，姜黄素调控Notch1信号通路可能是分子机制之一。本研究仅为姜黄素治疗结直肠肿瘤提供理论参考，更深入探讨姜黄素抗肿瘤的分子机制仍然是未来抗癌研究方向。

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（本文编辑 杨 瑛）

Curcumin Promoting Apoptosis of Colon Cancer Cell line SW480 by Regulating Notch1 Signal Pathway

Shao-Qiong Liu,Fang Yang,Zheng-Yang Yu,Chun-Hua Li,Ya Liu,Wan-Ying Liu
(The First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To investigate molecular mechanism of curcumin in promoting apoptosis of colon cancer cell line SW480 through Notch1 signal pathway.Methods (1)The apoptosis of colon cancer cell line SW480 treated by diverse concentrations of curcumin(0，7.5，15，30，60 μmol/L)for 24 hours and 48 hours were tested by flow cytometry method.(2) The mRNA expressions of gene Notch1 and gene Hes-1 in Notch1 signal pathway of colon cancer cell line SW480 were detected by RT-PCR,which was treated by diverse concentrations of curcumin(0，7.5，15，30，60 μmol/L).Results(1) Curcumin could promote apoptosis of colon cancer cell line SW480.(2)Curcumin could decrease mRNA expressions of gene Notch1 and gene Hes-1 of colon cancer cell line SW480(P＜0.05).Conclusion Curcumin could accelerate apoptosis of colon cancer cell line SW480,and the effect of anticancer may be associated with regulating mRNA expressions of gene Notch1 and Hes-1 in Notch 1 signal pathway.

curcumin;Notch1 signal pathway;colon cancer;SW480;apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.005

2015-05-07

湖南省自然科学基金资助项目（11JJ6083）。

刘少琼，女，主任医师，副教授，硕士研究生导师，E-mail:liushaoqiong861224＠126.com。