东北朝鲜族泡菜中乳酸菌的分离鉴定*

何文兵，慈 慧，张美娟

(1.通化师范学院 制药与食品科学学院，吉林 通化 134002；2.通化师范学院长白山食品工程研究中心，吉林 通化 134002；

3.通化市产品质量检验所，吉林 通化 134002)

东北朝鲜族泡菜中乳酸菌的分离鉴定*

何文兵1,2，慈 慧3，张美娟1

(1.通化师范学院 制药与食品科学学院，吉林 通化 134002；2.通化师范学院长白山食品工程研究中心，吉林 通化 134002；

3.通化市产品质量检验所，吉林 通化 134002)

以朝鲜族泡菜为原料从中筛选乳酸菌，通过对形态特征、生理生化等进行初步鉴定，从中筛选出15株乳酸菌，以产酸速度快、亚硝酸盐降解能力强等指标为依据，优选出发酵性能好的5株乳酸菌：LB5、LB6、LB7、BC6、BC8．

乳酸菌；分离；鉴定

泡菜是我国的传统发酵制品，不同地域的产品不同，国内尤以四川泡菜为典型，而东北地区的泡菜则以朝鲜族泡菜最具代表性．现代微生物学的发展, 进一步揭示了乳酸菌对人体健康有益作用的机理[1]，使用乳酸菌发酵加工的泡菜引起了国内外研究人员的重视．在泡菜的发酵过程中乳酸菌优越的发酵性能够缩短发酵的时间、提高泡菜的品质、延长泡菜食用期，同时在降低亚硝酸盐含量、防腐抑菌等方面都有重要作用[2]．本试验以朝鲜族泡菜“金刚山泡菜”为原料，研究东北地区朝鲜族泡菜中乳酸菌的多样性，从中分离筛选优势乳酸菌，并结合当地的资源优势，应用到长白山区山野菜泡菜产品的开发中，实现长白山地区山野菜资源的深加工，促进当地资源优势的有力转化，服务地方经济．

1 材料与方法

1.1 材料

LB：“金刚山”朝鲜族萝卜泡菜；BC：“金刚山”朝鲜族白菜泡菜．

1.2 药品及仪器

酵母膏，蛋白胨，酵母浸粉，牛肉浸粉，葡萄糖，柠檬酸二铵，硫酸镁，琼脂粉，磷酸氢二钾，硫酸锰，乙酸钠，吐温80，碳酸钙，亚硝酸钠，氯化铵，乙酸，对氨基苯磺酸，盐酸萘乙二胺，葡萄糖，无水碳酸钙， 95%乙醇，氯化钠，盐酸，三氯化铁；(以上化学试剂均为分析纯)．

精密酸度计，NOSHP0101239131 (上海大谱仪器有限公司)；电子天平，MPZ1001 (上海恒平科学仪器有限公司)；净化工作台，CWCJ-CJ系列 (上海恒平科技有限公司)；生化培养箱SPX-100B-2 (上海博迅实业有限公司)；生物显微镜，B203LED (重庆奥特光学仪器有限公司)；离心机 TDL80-213(上海安享科学仪器厂制造)；立式压力蒸汽灭菌器 TDL80-2B(上海博迅实业有限公司)；空气恒温摇床 KYC-100C(上海新苗医疗器械制造有限公司)；干燥箱DHG-9245A型(上海一恒科学仪器有限公司)；生化培养箱SPX-150B-Z (上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；低温冰箱BCD-186D (合肥美菱股份有限公司)；722分光光度计．

1.3 培养基的配制

MRS固体培养基[3]：蛋白胨 10g；牛肉浸粉 10g；酵母浸粉 5g；葡萄糖 20g；柠檬酸二铵2g；硫酸镁0.58g；磷酸氢二钾2g；硫酸锰0.25g；乙酸钠5g；吐温801mL；琼脂粉15g；蒸馏水1000mL．调pH值6.2～6.4，121℃灭菌15min．MRS液体培养基[3]：蛋白胨 10g；牛肉浸粉 10g；酵母浸粉 5g；葡萄糖 20g；柠檬酸二铵2g；硫酸镁0.58g；磷酸氢二钾2g；硫酸锰0.25g；吐温801mL；乙酸钠5g；蒸馏水1000mL．调pH值6.2～6.4，121℃灭菌15min．

2 方法

2.1 乳酸菌分离纯化及保藏

其流程为：泡菜样品→乳酸菌分离→纯化→乳酸菌的形态鉴定→生理生化鉴定→斜面保藏→增殖培养→亚硝酸的降解率→产酸定性鉴定→菌种保藏[4]．以无菌操作，定量称取泡菜及汁，匀浆后放在灭菌的试管中用无菌水进行梯度稀释，选取适宜的稀释度，取1mL于培养皿中，以灭菌的45～50℃的加有2%CaCO3的MRS固体培养基倾倒平板，于培养箱中37℃培养48h，挑取有溶钙圈的黄色单菌落，具有典型乳酸菌菌落特征的菌株进行反复分离、纯化至纯菌落．将各菌株编号、保存待鉴定．

2.2 乳酸菌的鉴定

(1)乳酸菌的初步鉴定.形态鉴定方法[3,4]：取保存编号乳酸菌分别接种到MRS平板培养基上，30℃培养48h，取典型的菌落做革兰氏染色，用显微镜观察菌体特征．

生理生化试验[5]：鉴定方法，触酶试验，用接种环挑取细菌置于洁净的载玻片上，滴加3%～15%的过氧化氢溶液1滴，立即观察结果，若有气泡产生则细菌为阳性，若无气泡产生则细菌为阴性．对革兰氏染色阳性、触酶试验阴性的菌落继续于4℃条件下保藏．该环节以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌做对照．

(2)产酸速度实验[6].pH法测定产酸速度：取初步筛选完的乳酸菌活化后，用接种环轻轻挑一环接入已灭菌的10mL MRS液体培养基中，于30℃下震荡培养18h后，按1%的接种量取此菌悬液0.5mL接入50mL已灭菌的MRS液体培养基中，于30℃下震荡培养，并每隔2h取样5mL测定其pH值，考察其对葡萄糖的发酵产酸作用．

(3)亚硝酸盐降解实验.分别吸取0、0.20、0.40、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50mL NaNO2标准液(相当于0μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg NaNO2)，分别置于50mL比色管中．在标准液与样品液管中分别加入2mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液(2g·L-1)，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线．取初步筛选完的乳酸菌活化后接入已灭菌的10mL MRS液体培养基中，于30℃下震荡培养18h后，按1%的接种量取此菌悬液1mL分别接入100mL已灭菌的含有NaNO2(10mg·L-1)的MRS液体培养基中，于30℃震荡培养72h．将含菌体的培养基用高速离心机3500r/s离心两次，每次10min以去除菌体．采用盐酸萘乙二胺法测定其亚硝酸盐含量．

盐酸萘乙二胺法[7]：吸取40mL上述滤液于50mL比色管中，加入2mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液摇匀．静置3～5min后，加入1mL 0.2%的盐酸萘乙二胺溶液，并用蒸馏水定容到50mL,摇匀静置15min后用分光光度计在538nm波长下测定吸光度，同时以不加NaNO2且不接种乳酸菌的MRS液体培养基为对照．

表1 革兰氏染色结果

3 结果与分析

3.1 乳酸菌的分离纯化结果

从金刚山朝鲜族萝卜泡菜中分离出7株乳酸菌，分别命名为LB1、LB2、LB3、LB4、LB5、LB6、LB7;从金刚山朝鲜族白菜泡菜中分离出8株乳酸菌，分别命名为BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC8．

3.2 革兰氏染色结果

乳酸菌涉及到乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属等，其形态特征为革兰氏染色阳性、无鞭毛．基于显微镜下菌体的颜色及形态，上述分离到的微生物初步被定性为乳酸菌(表1、图1)．

图1 不同来源的乳酸菌菌株油镜观察

3.3 接触酶反应结果[3]

分别对15个菌株进行接触酶实验，观察其是否产生气体，并以此判定接触酶实验结果．

表2 接触酶实验结果

由表2可知，LB3、LB4、LB5、LB6、LB7、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC8均为接触酶阴性，符合乳酸菌的特性，所以将以上菌株保留．

3.4 产酸实验结果

图2 产酸速率曲线

由图2可知，在12h的检测中发现，pH值变化幅度较大的发酵液其菌种的产酸能力相对较强，即LB3、LB4、LB5、LB6、LB7、BC5、BC6、BC8产酸速率较好．其中由于BC2,BC3产酸速率不理想，所以将其淘汰．

3.5 亚硝酸盐盐降解结果

图3 亚硝酸盐标准曲线

亚硝酸盐含量在0～14ug之间，吸光度在0～0.2之间，据此绘制亚硝酸盐标准曲线(图3)．通过标准曲线计算样品中的亚硝酸盐含量．降解率等于培养基中NaNO2减少的量/10mg·L-1与未接菌的培养基中的NaNO2的含量/10mg·L-1之比乘100%．

表3 亚硝酸盐降解率(%)

由表3可知，LB5、LB6、LB7、BC6、BC8的亚硝酸盐降解率较好，其中LB3、LB4、LB6、BC5由于亚硝酸盐降解率不好，所以将其淘汰．

4 结论与讨论

经革兰氏染色、形态鉴定、接触酶反应等试验，从朝鲜族金刚山泡菜中分离到15株乳酸菌菌株，并以产酸速率，亚硝酸盐降解能力等为指标从中优选出5株乳酸菌分别命名为LB5、LB6、LB7、BC6、BC8．同时发现来源于辣白菜中的菌株以球菌为主，而酸萝卜中的乳酸菌以杆菌为主，表明不同的乳酸菌对底物的营养要求有区别．

作为优化筛选的这5株乳酸菌将对其进行后续的深入研究，并将其应用到山野菜泡菜的发酵试验，以考察其对原料的适应性，为后续产品的研发奠定基础．

[1]Cherl- Ho L. Lactic acid fermented foods and their benefits in Asia[J]. Food Control, 1997, 8(5-6):259-269.

[2]杨雪.发酵蔬菜中乳酸菌的分离鉴定及其应用研究[D].武汉:武汉工业学院,2008.

[3]苏世彦.食品微生物检验手册[M].北京:中国轻工业出版社,1998.

[4]吴元锋,邹礼根.泡菜中乳酸菌的分离、鉴定及其发酵性能研究[J].中国食品学报,2007,7(5):42-46.

[5]凌代文,东秀珠.乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999.

[6]尹利端.几种泡菜的安全性研究与优良乳酸菌的分离、鉴定[D].北京:中国农业大学,2005.

[7]中国标准出版社第一编辑室.中国食品工业标准汇编[M].北京:中国标准出版社,2001.

(责任编辑:陈衍峰)

10.13877/j.cnki.cn22-1284.2015.04.004

2014-11-21

吉林省科技发展计划项目“长白山山野菜泡菜生产加工关键技术研究及生产应用”(2013419008CB)；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目“长白山山野菜泡菜生产加工关键技术研究”(吉教科合字[2013]第495号)；通化师范学院校级项目“长白山山野菜泡菜生产加工关键技术研究”(201270)

何文兵,吉林九台人,在读博士,副教授．

Q93

A

1008-7974(2015)02-0011-03