红景天提取物体外抗肿瘤转移作用机制研究

王媛媛，林 宏

(天津市儿童医院，天津 300074)



实验研究

红景天提取物体外抗肿瘤转移作用机制研究

王媛媛，林 宏*

(天津市儿童医院，天津 300074)

目的：研究红景天提取物体外抗肿瘤转移作用机制。方法：采用MTT、划痕实验、matrigel侵袭实验、血管生成实验及Western blot蛋白免疫印迹实验分别检测红景天提取物不同浓度对人乳腺癌细胞MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒作用、侵袭能力、迁移能力和血管生成能力的影响。结果：红景天提取物40 mg/ml对人乳腺癌细胞MDA-MB-231及HUVEC均无毒性，在不同浓度下均能抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭、迁移能力及HUVEC血管生成能力，并能显著性抑制PI3K/Akt信号通路Akt及PKCζ蛋白磷酸化水平。结论:红景天提取物能够从抑制肿瘤细胞侵袭、迁移及血管生成多方面发挥抗肿瘤转移作用,并通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制肿瘤细胞的转移。

红景天提取物，乳腺癌细胞，人脐静脉内皮细胞，抗肿瘤细胞转移，血管生成

红景天为景天科景天属(RhodiolaroseaL)多年生草本或亚灌木珍稀野生植物，多生长在海拔3 500～5 000 m的高山流石或灌木丛中[1,2]。研究结果显示，红景天中含有多种化合物，其中红景天苷是迄今研究最多的有效活性成分，已被广泛用于预防高原病、抗衰老、抗抑郁、抗肿瘤及消除疲劳等方面。已有动物实验结果显示，红景天苷可以抑制多种肿瘤细胞的增殖[3]。但目前关于红景天对肿瘤细胞转移的作用机制研究较少。本文以人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人脐静脉内皮细胞为研究对象，对红景天提取物体外抗肿瘤转移作用机制进行探讨。

1 实验材料

1.1 细胞 人乳腺癌细胞MDA-MB-231(中国科学院上海细胞库)；人脐静脉上皮细胞(百奥迈科生物技术有限公司)。

1.2 试剂与药品 狭叶红景天(四川艾丽碧丝制药有限公司)；RPMI1640培养液 (HyClone)；胎牛血清(Bioind)；PBS(HyClone)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma)；(含25%EDTA)胰蛋白酶(Bioind)；基底胶matrigel(Invitrogen)；HUVEC培养液(百奥迈科生物技术有限公司)。

1.3 仪器 细胞培养箱(Heal Force公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；全自动酶标板分析仪(BIO-RAD公司)；倒置显微镜 (Olympus公司)；电泳仪(美国伯乐公司)；Transwell小室(Corning)；培养皿、96孔酶标板、6孔板(Nest)。

2 实验方法

2.1 红景天提取物的制备 取20 g狭叶红景天，用粉碎机粉碎后置于圆底烧瓶中，加入10倍体积的95%乙醇，80 ℃水浴加热回流1 h，用纱布过滤提取液。残渣中再加入8倍体积的75%乙醇，80 ℃水浴加热回流1 h，用纱布过滤提取液。残渣中再加入8倍体积的50%乙醇，80 ℃水浴加热回流1 h，用纱布过滤提取液。残渣中最后加入6倍量水，80 ℃水浴加热回流1 h，用纱布过滤提取液。将四次提取液混合，减压浓缩，65 ℃真空干燥箱内真空干燥过夜，得到6 g干粉样提取物，经检测，每1 mg干粉含红景天苷16.0 μg。使用时红景天提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解成高浓度储备液，再用培养液稀释成相应浓度作用于细胞，其DMSO含量小于0.1%。以此制得高、中、低三个浓度分别为10、20和40 mg/ml的红景天提取物溶液。

2.2 细胞培养 MDA-MB-231细胞和HUVEC分别用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液和含10%血清的HUVEC专用培养液进行培养，将培养皿置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养，待其长满培养皿底时，弃去培养液，加入胰蛋白酶消化液约2 ml，显微镜下观察，待细胞质回缩，细胞间隙增大，终止消化，小心去除消化液，加入6 ml培养液反复吹打，使细胞从皿底脱落后，形成细胞悬液，镜下观察细胞。等份分装3～4皿，继续放于37 ℃、5%CO2孵箱培养。

2.3 MTT细胞毒实验 将细胞用0.25%胰酶消化，吸出胰酶后，用含10%FBS的培养液终止消化，混匀细胞悬液，计数，调节细胞密度为1×104个/ml。将调好的细胞悬液加于96孔板，每孔180 μl，置于37 ℃、5%CO2孵箱内培养24 h，24 h后加药，每个浓度5个复孔，继续置于37 ℃、5%CO2孵箱内培养48 h。之后每孔加5 mg/ml的MTT 15 μl，37 ℃、5%CO2孵箱内培养4 h，4 h后取出96板，将上清液吸出，每孔加100 μl的DMSO，用酶标仪在490 nm波长下测量吸光度。抑制率 (%) =[1-(加药组OD值/空白组OD值)]×100%。

2.4 划痕实验 收集对数生长期的细胞，均匀接种于六孔板中；待细胞长至完全融合后，用10 μl无菌枪头在每孔单层细胞中央轻轻地划一道伤痕，沿划痕边缘等距离间隔做上标记，以便检测；PBS冲洗，换液后分别用不同浓度的化合物处理24 h；然后用倒置显微镜观察划痕愈合程度并拍照，利用IPPWIN60统计划痕距离，然后进行统计学分析，抑制率 (%) =[1-(空白组0 h距离-加药组24 h距离)/(空白组0 h距离-空白组24 h距离)]×100%。

2.5 Matrigel侵袭实验 实验开始前6 h，将matrigel用PBS稀释8倍后加入到Transwell小室的上室，50 μl/小室，置于37 ℃、5%CO2培养箱内6 h，让matrigel凝固，6 h后将加药处理24 h的细胞消化后离心弃去培养液，用无血清培养基重悬，调整细胞密度至5×105个/ml；取细胞悬液100 μl加入Transwell小室的上室，下室一般加入650 μl含10% FBS的培养基，同时上下室各加入终浓度相同的待处理化合物；37 ℃、5%CO2培养 18 h后，弃去上室液体，用棉签擦去膜上未迁移的细胞和matrigel；用PBS洗2遍，90%乙醇固定30 min，0.5%曙红染色20 min后，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞；每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内的穿过8 μm微孔的细胞数，抑制率 (%) =[1-(加药组细胞数/空白组细胞数)]×100%。

2.6 血管生成实验 血管生成实验方法参照文献[4]，稍有改进。matrigel胶于4 ℃过夜融化，同时将枪头和96孔板于-20 ℃预冷备用；实验时将预冷的96孔板置于冰上，用预冷的枪头吸取matrigel胶50 μl/well加入到孔中并避免气泡形成，然后将96孔板放入37 ℃细胞培养箱，放置1 h使胶凝固；已用不同浓度化合物共培养24 h的HUVEC细胞，用胰酶消化，计数并稀释，将密度为1×105个/ml的细胞100 μl/well接种于预先铺好的matrigel上，继续培养12 h；倒置显微镜下观察细胞的变化并拍照记录小管形成情况,每孔随机摄取3个视野，整个实验重复三次。

2.7 蛋白质免疫印迹实验 加药处理24 h的细胞加裂解液裂解后，12 000 r/min离心20 min，取上清，加入5×蛋白上样缓冲液95 ℃沸煮5 min后在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳结束后转印至PVDF膜上，然后用5%的脱脂牛奶封闭1 h，洗膜后分别加入Akt、PKCζ和β-actin的抗体，浓度为1∶1 000稀释，4 ℃过夜。再次洗膜后加入第二抗体进行反应，室温孵育1 h，洗膜后ECL荧光显色和曝光。利用图像分析系统确定X线光胶片上蛋白条带的相对灰度。

3 结果

3.1 红景天提取物对细胞的毒性作用 本实验测定了红景天提取物低、中、高三个浓度(10、20和40 mg/ml)对乳腺癌细胞MDA-MB-231和人HUVEC细胞的毒性，提取物与细胞共孵育24 h后采用MTT比色法检测提取物各浓度下对细胞增殖的抑制作用，用吸光度值(OD值)按照抑制率计算公式计算抑制率，结果见表1，红景天提取物各浓度对两种细胞系均未显示出显著的细胞毒性作用。

3.2 红景天提取物对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 划痕实验(又称伤口愈合实验)是检测细胞迁移能力的一种方法。在没有诱导因子的情况下，细胞可以感受到“伤口”，并通过重组微管组织中心沿垂直于伤口划痕的方向运动。

本实验采用该方法为评价手段，测定红景天提取物在非细胞毒剂量下对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响。待细胞单层贴壁后用枪头均匀的划出一道伤痕，同时给予各浓度红景天提取物与细胞共培养，24 h后观察伤痕愈合情况，用微镜测微尺测量两处伤痕宽度，见图1，各给药组的伤痕宽度均比空白组宽，且具有显著性差异(P<0.01)。此外，三个剂量组分别与空白组比较，计算红景天提取物对MDA-MB-231迁移能力的抑制率，实验结果见图2。红景天提取物各浓度组剂量依赖性抑制乳腺癌细胞的迁移，其40 mg/ml浓度下的抑制率为93.75%，显示出极强的抑制作用。

表1 红景天提取物对MDAMB231和HUVEC的细胞毒性

图1 红景天提取物对MDA-MB-231迁移能力的影响

图2 红景天提取物对MDA-MB-231迁移能力的抑制率

3.3 红景天提取物对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响 人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似，当Transwell小室上室滤膜被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似，见图3。利用该实验观察红景天提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的影响，计数给药孵育24 h的细胞穿过Matrigel的数量，各给药组的细胞数与空白组比较均有显著性差异(P<0.01)。抑制率结果显示红景天提取物对乳腺癌细胞的侵袭能力具有显著的抑制作用，并呈现一定的剂量依赖性，见图4。

图3 红景天提取物对MDA-MB-231侵袭能力的影响

图4 红景天提取物对MDA-MB-231侵袭能力的抑制率

3.4 红景天提取物对HUVEC细胞血管生成能力的影响 肿瘤的血管生成是一个复杂的病理生理过程，包括内皮细胞释放蛋白酶、基底膜降解、内皮细胞迁移、增殖和内皮细胞形成管腔。肿瘤的生长是血管依赖性的，因而血管化的肿瘤生长速度加快且易发生转移。因此通过抑制新生血管的形成来治疗肿瘤，已经成为肿瘤治疗的新策略。本试验利用人HUVEC体外血管生成实验模拟体内的血管生成。实验结果显示，红景天提取物能够有效地抑制HUVEC血管生成的能力，并呈现一定的剂量依赖性，在高浓度作用下已经完全抑制了HUVEC细胞小管的形成，见图5。

图5 红景天提取物对HUVEC血管生成的抑制作用

3.5 红景天提取物对相关蛋白磷酸化的影响 基于以上实验结果，本文进一步就红景天提取物对肿瘤细胞转移抑制作用机制进行了研究，利用蛋白质免疫印迹实验检测了红景天提取物对与肿瘤细胞迁移相关蛋白硫酸化水平的影响。实验结果显示，红景天提取物能够有效地抑制MDA-MB-231细胞的Akt及PKCζ的磷酸化水平，并呈现一定的剂量依赖性，见图6。实验结果为3次平行实验的均值。以误差线代表标准差，低、中、高剂量组与空白组比较均有统计学意义，分别为P<0.05、P<0.01和P<0.001。

图6 红景天提取物对Akt、PKCζ蛋白磷酸化水平的影响

4 讨论

红景天在民间被称为“黄金根”，显示出其重要的药用价值。我国红景天资源丰富，分布广泛，作为药用植物入药应用历史悠久。近代药理学研究显示，其不仅在体外有抑制肿瘤细胞生长的作用，如Hela细胞[5]、肝癌QGY-7703细胞[6]、肺腺癌细胞SPC-A-1[7]，而且在体内实验中也显示出很好的抑瘤作用。实验研究显示，不同剂量的红景天苷能够剂量依赖性抑制人肝癌细胞SMMC-7721的c-myc表达，降低肝癌的恶性程度[8]。体内药理实验研究发现，红景天提取物能够抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的VEGF蛋白表达，提示其在体内可能具有抑制肿瘤血管生成的作用[9]；此外体内实验观察红景天提取物经灌胃给药处理对荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，结果显示红景天组的抑瘤率达到了70.9%，显示出极好的肿瘤抑制作用[10]。

红景天临床应用上主要集中在心脑血管疾病方面，其抗肿瘤作用实验报道较多，但其临床应用报道少见，目前仍处于辅助用药的地位。虽然红景天抗肿瘤作用的报道较多，但多为宏观效果的报道，其具体的抗肿瘤作用机制研究较少，本实验着重对红景天提取物对抑制肿瘤细胞转移方面做了深入探讨，就肿瘤细胞的迁移、侵袭及血管生成三个方面，从肿瘤转移必经的几个阶段对其进行了研究。实验结果显示，红景天提取物在无细胞剂量下剂量依赖性抑制肿瘤细胞MDA-MB-231的迁移、侵袭及人脐静脉内皮细胞HUVEC的血管生成，进一步机制研究显示，红景天提取物能够剂量依赖地抑制肿瘤转移重要信号通路PI3K/Akt的蛋白磷酸化，显示出显著的抑制肿瘤细胞转移的作用。

肿瘤细胞的侵袭转移是恶性肿瘤的主要特征，是引起恶性肿瘤患者死亡的首要因素，如果能有效地抑制肿瘤细胞的转移，就能显著地降低肿瘤的致死率。因此，抑制肿瘤细胞转移药物的研究也成了近年研究热点，本实验对红景天提取物抑制肿瘤细胞转移的作用机制进行了探讨，将为其应用与临床治疗肿瘤提供坚实的理论依据，使其更好地应用于临床。

1 徐宝军, 郑毅男,李向高. 红景天属植物研究新进展[J].中药材,2000,23(9):580-584

2 Panossian A,Wikman G,Sarris J. Rosenroot (Rhodiola rosea): traditional use,chemical composition,pharmacology and clinical efficacy [J].Phytomedicine,2010, 17(7): 481-493

3 Hu X,Lin X,Yu D,etal. A preliminary study: the anti-proliferation effect of salidroside on different human cancer cell lines [J]. Cell Biol Toxicol,2010, 26(6): 499-507

4 Xiao D, Singh S V. Phenethyl Isothiocyanate Inhibits Angiogenesis In vitro and Ex vivo [J].Cancer Res, 2007, 67(5): 2239-2246

5 Yang J, Liu Y L. Dissection of key events in tubular epithelical to myfibroblasttransition and its implication in renal interstitial fibrosis [J].Am J Pathol, 2001, 159(4): 1465-1475

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Mechanism of anti-tumor metastasis forRhodiolaextraction in vitro

Wang Yuanyuan，Lin Hong

(Tianjin Children′s Hosptial, Tianjin 300074)

Objective：To study the mechanism of anti-tumor metastasis forRhodiolaextraction in vitro. Methods：The effects ofRhodiolaextraction on cytotoxicity, cell migration, invasion, tube formation and the phosphorylation of protein of human breast cancer cell(MDA-MB-231) and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) were measured by MTT assay, wound healing assay, invasion assay, tube formation assay and western blot assay, respectively. Results：Rhodiolaextraction exhibited no cytotoxicity for MDA-MB-231 and HUVEC cells at 40 mg/ml, and inhibited cell migration, invasion and tube formation with various concentrations. Furthermore,Rhodiolaextraction also decreased phosphorylation of Akt and PKCζ on PI3K/Akt signaling pathway significantly. Conclusion：Rhodiolaextraction can suppress anti-tumor metastasis by inhibiting cancer cell migration, invasion, tube formation, and the PI3k/Akt signaling pathway.

Rhodiolaextraction， breast cancer cell，HUVEC，anti-tumor metastasis， tube formation

2015-09-17

R979.1

A

1006-5687(2015)06-0001-05

*通讯作者：林宏，E-mail：jane1523@163.com。