表没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠运动疲劳的拮抗作用*

黄诚胤， 潘建华， 李 慧

(重庆大学体育学院， 重庆 400044)



表没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠运动疲劳的拮抗作用*

黄诚胤△， 潘建华， 李 慧

(重庆大学体育学院， 重庆 400044)

目的：探索腹腔注射表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对小鼠运动疲劳的拮抗作用。方法：将120只小鼠随机分为生理盐水对照(1 ml/kg·d)(A组)、EGCG低浓度组(10 mg/kg·d)(B组)、EGCG高浓度防护组(50 mg/kg·d)(C组)(n=40)。建立疲劳小鼠训练模型，每天腹腔注射不同剂量的EGCG或生理盐水，持续给药28 d。检测小鼠负重游泳、轮转耐力、爬杆、动物耐缺氧时间及血乳酸水平(BLA)、血尿素氮(BUN)、血乳酸脱氢酶(LDH)及肝糖原(LG)、肌糖原(MG)等疲劳相关指标。结果：腹腔注射EGCG组(B组、C组)小鼠负重游泳、爬杆、轮转耐力持续时间及耐缺氧存活时间显著延长，且较对照组相比具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；同时提高小鼠血清中LDH浓度，降低BLA、BUN浓度及升高MG和LG含量。高浓度EGCG的抗疲劳效果与低浓度组相比更为明显(P<0.05)。结论：EGCG具有拮抗小鼠运动疲劳的作用。

儿茶素没食子酸酯；运动疲劳；拮抗作用；小鼠

运动性疲劳是指在运动过程中，机体的机能或工作效率不能维持在特定的水平而出现运动能力和身体功能暂时下降的现象[1]。运动疲劳产生的原因包括能源物质的耗竭、代谢产物的堆积，机体内环境失衡等。茶叶中含有的茶多酚，具有很强的抗氧化和清除自由基的能力。茶多酚中的儿茶素类化合物约占茶多酚总量的70%～80%，其中，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)含量最高，占儿茶素总量的50%以上。以往研究表明EGCG具有抗癌、抗突变、预防和治疗心脑血管系统疾病等生物活性[2，3]。

本实验以昆明小鼠为研究对象，给予低、高两种浓度EGCG溶液腹腔注射。测试小鼠进行负重游泳能力、爬杆及转轮耐力；观察动物在常压下耐缺氧的时间；检测了动物血乳酸水平(blood lactic acid, BLA)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血乳酸脱氢酶(blood lactate dehydrogenase, LDH)及肝糖原(liver glycogen, LG)、肌糖原(muscle glycogen, MG)等疲劳相关指标的变化，探讨EGCG对小鼠运动性疲劳过程中对能源物质的耗竭、代谢产物堆积的影响，以及对小鼠运动能力的影响，为日后研究EGCG对小鼠运动性疲劳具有拮抗作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

本实验采用120只4～6周龄SPF级健康昆明小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，动物由第三军医大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(渝)2007-0003)。实验小鼠随机分为3组(n=40)，10只/笼饲养。动物饲养环境：温度(23±2)℃，保持通风，自然昼夜节律变化，相对湿度40%～60%。由第三军医大学实验动物饲养中心新鲜配制动物饲料。

实验分为生理盐水对照组(A组)腹腔注射等量生理盐水(1 ml/kg·d)、低浓度EGCG组(B组：10 mg/kg·d)、高浓度EGCG组(C组：50 mg/kg·d)，各组持续给药28 d，并且每组饲养条件相同。每组再随机分4组为负重游泳、转轮耐力、爬杆及常压耐缺氧时间的测定。

1.2 试剂与器材

EGCG标准品(纯度>95%)(美国Sigma公司)；戊巴比妥钠(成都科龙化工试剂厂)；0.01 mol/L PBS、(北京中杉金桥生物技术有限公司)；乳酸(BLA)试剂盒(南京建成生物工程研究所生产，批号：110802)；LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所生产，批号：110610)；BUN测试盒(南京建成生物工程研究所生产，批号：110928)；LG试剂盒(南京建成生物工程研究所生产，批号：110404)；MG试剂盒(南京建成生物工程研究所生产，批号：110618)。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠爬杆实验 直径1 cm，长100 cm的玻璃棒上端固定于爬杆架上，下端距地面约40 cm处悬空，底部放入一装水容器，水温20℃，水深20 cm。动物适应性喂养4 d后开始给予适应性训练，每2天1次，每次4～5 min。每次训练前30 min注射生理盐水及不同浓度EGCG。28 d适应性训练后，无运动功能异常的小鼠进行测试。末次腹腔注射30 min后，将小鼠置于设置好的爬杆下端，记录从小鼠放置开始至因疲劳无力而从上端滑落的时间，重复3次，时间累加。

1.3.2 小鼠负重游泳 动物适应性喂养4 d后开始进行3 d适应性游泳训练，每天1次，每次15 min。游泳训练在直径120 cm，宽50 cm，水深30 cm的容器中进行，水温(25±2)℃。每天实验开始前30 min A组动物腹腔注射生理盐水、B组动物腹腔注射10 mg/kg EGCG、C组动物腹腔注射50 mg/kg EGCG。各组小鼠腹腔注射30 min后陆续放入游泳池内游泳，每次游泳30 min，每天逐渐递增10 min游泳时间。游泳完成后，取出动物擦干，放入笼中休息。力竭小鼠提前取出，记录每只小鼠的训练时间及状态，训练持续28 d。游泳训练完成后，在小鼠尾部负载其体重8%的负荷，将小鼠放入游泳池内进行游泳实验，记录小鼠从入水到力竭的时间。

1.3.3 小鼠转轮耐力实验 将转轮底部置于水盆中，水没过转轮底部。动物适应性喂养4 d后开始给予适应性训练，每天1次，每次1～2 min。每天实验开始前30 min A组动物腹腔注射生理盐水、B组动物腹腔注射10 mg/kg EGCG、C组动物腹腔注射50 mg/kg EGCG。28 d适应性训练后，再次将小鼠放置于转轮中，让其自行转动，观察小鼠转动疲劳状况，记录小鼠在转轮中不再自主前行转动的时间[4]。

1.3.4 小鼠在常压下耐缺氧时间测定 爬杆实验结束后，小鼠休息3 d，实验各组分别每天腹腔注射生理盐水及不同浓度的EGCG，连续注射28 d。末次腹腔注射30 min后，将其装入250 ml 广口瓶中，广口瓶里放入纱布包裹15 g CaCl2，每瓶放置1只小鼠，塞紧瓶盖，凡士林封口，检查不漏气后开始记录小鼠全身出现痉挛需要的时间。然后开启瓶盖，记录小鼠存活时间[5]。

1.3.5 标本采集 以上实验数据收集完后，进行动物样本的采集。动物处死前禁食12 h，采用腹腔内注射3%戊巴比妥钠( 50 mg/kg 体重) 麻醉，眼眶及心脏采血。血样于室温静置2 h 后，3 000 r/min 离心10 min，分离血清，1.5 ml EP 管分装，标记，-70℃冰箱中保存。采血后，剥离出小鼠完整肝脏组织和双下肢肌肉，用预冷生理盐水冲洗血液，滤纸吸干组织表面水分，再用灭菌锡泊纸包裹后储于液氮中保存。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 EGCG对小鼠爬杆能力的影响

B组与C组训练小鼠爬杆能力显著高于A组小鼠(P<0.01)，而B组小鼠爬杆持续能力明显低于C组小鼠，B组与C组训练小鼠的爬杆能力相比较也有显著性差异(P<0.05，图1)。

2.2 EGCG对小鼠负重游泳时间的影响

C组的训练小鼠负重游泳时间与A组相比有显著性差异，其负重力竭游泳时间较A组显著性延长(P<0.05，图2)。

2.3 EGCG对小鼠轮转耐力时间的影响

B组与C组训练小鼠轮转耐力持续时间显著长于A组小鼠(P<0.01)，而B组训练小鼠的轮转耐力时间低于C组，有显著性差异(P<0.05，图3)。

2.4 EGCG对小鼠耐缺氧时间的影响

C组的训练小鼠缺氧存活时间与A组相比有显著性差异，其耐缺氧时间较A组显著性延长(P<0.01，图4)。B组与C组小鼠的耐缺氧存活时间无显著性差异。

2.5 EGCG对小鼠BLA、LDH和血清BUN含量的影响

BLA、LDH和BUN是评判疲劳的重要指标。与A组相比，B组、C组小鼠运动后BLA、BUN含量呈降低趋势，LDH呈增高趋势。表明EGCG能降低小鼠运动后BLA、BUN含量，并增加LDH活性。其中，B组BLA含量与A组相比有显著性差异(P<0.05)，LDH和血清BUN含量与A组相比，差异不显著；C组与A组相比，各项指标均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。

GroupBLA(nmol/L)LDH(U/L)BUN(mmol/L)A11.01±1.984678.35±611.7810.06±0.19B8.91±1.83*5029.97±444.909.91±1.07C7.77±1.76*5987.19±675.24**8.99±1.21*

A: Control group; B: Low dose group; C: High does group;

BLA: Blood lactic acid； LDH： Lactic dehydrogenase； BUN： Blood urea nitrogen; EGCG: Epigallocate chin gallate

*P<0.05,**P<0.01vsA group

2.6 EGCG对小鼠MG和LG含量的影响

与A组相比，B组与C组小鼠运动后MG和LG含量均呈增高趋势。其中C组小鼠MG、LG含量具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。该结果提示高浓度EGCG可促进无氧酵解产生的乳酸尽快转化为葡萄糖，帮助运动后的小鼠恢复体内能量供给(表2)。

GroupMG(mg/g)LG(mg/g)A0.78±0.194.97±0.33B0.75±0.074.86±0.51C0.91±0.09*5.55±0.40**

A: Control group; B: Low dose group; C: High does group;

MG： Muscle glycogen； LG： Liver glycogen; EGCG: Epigallocate chin gallate

*P<0.05，**P<0.01vsA group

3 讨论

随着竞技体育水平日益提高，运动员在训练过程中承受的心理压力和运动负荷增强，出现运动性疲劳的几率在逐渐增加。如果运动性疲劳不能及时得到恢复，将影响运动员的运动能力。本实验采用负重游泳、爬杆、转轮耐力及动物在常压下耐缺氧时间四项指标较为全面地观察了EGCG对运动疲劳的拮抗作用。实验结果显示B组、C组小鼠与A组相比负重游泳、爬杆和轮转耐力及在常压下耐缺氧的时间均呈增高趋势，C组小鼠与A组相比各项指标均有显著性的提高(P<0.05，P<0.01)。小鼠运动耐力提高、负重游泳和轮转时间增加以及在常温下耐缺氧时间的延长从多方面提示：EGCG能在一定程度上改善动物提高平衡能力、协调动物大小肌肉群的力量输出、改善精细肌肉群的疲劳程度等多渠道对抗运动疲劳。目前已有多项研究指出，EGCG可显著增加机体的抗氧化能力，降低体内过氧化物生成，对酶依赖性和非酶依赖性抗氧化功能均有显著的作用[6，7]。本实验结果验证了EGCG可以拮抗运动疲劳的效应的假说，而这种效应是否通过EGCG拮抗组织过氧化与自由基的清除，而缓解运动引发的疲劳，从而促进运动能力的显著提高？其具体的分子作用机制还需进一步研究。

运动性疲劳可消耗机体大量的能量和氧气并产生大量乳酸。其最直接的表现即运动耐力下降[8，9]。剧烈运动会消耗机体的能量和氧气并生成大量乳酸，乳酸的解离可改变肌肉中pH值，进而引起酸碱平衡的变化，也是引起疲劳的重要原因之一。除此之外，BUN和LDH水平同样被视为反应机体有氧代谢能力和疲劳程度的重要指标。本研究结果显示，运动后B组、C组小鼠BLA和BUN水平呈下降趋势，C组与A组相比有显著性差异，LDH呈升高趋势，说明EGCG可能通过促进无氧酵解产生的乳酸向丙酮酸方向进行代谢转变，促进肌肉中乳酸尽快转化为葡萄糖。

糖是肌肉重要的能量供应源，长时间的运动可耗竭体内的糖原储备，此时，个体的运动能力，特别是耐力的持久性将受到严重影响。A组的研究结果提示，运动导致体力的消耗与肌糖原的耗竭同时发生，伴随肌糖原的逐渐消耗，机体需动员肝糖原来维持正常的血糖水平。因此MG和LG水平的变化也可以间接反应机体疲劳程度。分析表明：EGCG可提高小鼠血清中LDH浓度，降低BLA、BUN浓度，MG和LG含量升高，且高浓度EGCG的抗疲劳效果与低浓度组相比更为明显。本实验中，运动后C组小鼠的MG、LG水平与A组比较有显著性差异，但EGCG拮抗运动疲劳的作用究竟是源于其通过增加MG、LG储备还是降低MG、LG消耗，还有待进一步的科学论证。有研究表明，通过EGCG防护后能有效增强疲劳大鼠对新事物的探究及空间学习能力[10]。综上，EGCG可显著延长小鼠负重游泳、爬杆、轮转耐力持续时间及耐缺氧存活时间，能有效拮抗小鼠运动疲劳过程中代谢产物的堆积及缓解机体内环境失衡的作用。

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Effect of epigallocatechin gallate against exercise-induced fatigue in mice

HUANG Cheng-yin△, PAN Jian-hua, LI Hui

(Physical Education College, Chongqing University, Chongqing 400044, China)

Objective: To investigate the effects of epigallocatechin gallate (EGCG)against exercise-induced fatigue in mice. Methods: Total 120 mice were randomly divided into three groups and tested separately. For each test, there were 30 mice subdivided into high dose (50 mg/kg·d EGCG) and low dose (10 mg/kg·d EGCG) groups as well as saline control group(1 ml/kg·d) with 10 in each. Burden swimming, running wheel endurance, stick climbing and hypoxia tolerance exercise were used to establish fatigue mice training model in three groups. And intraperitoneal injection with different doses of EGCG per day for consecutively 28 days and the mice in the control group were treated with normal saline. After the last each test, the blood lactic acid (BLA), blood urea nitrogen (BUN), blood lactate dehydrogenase (LDH), muscle glycogen (MG) and liver glycogen (LG) of each group of mice were determined. Results: EGCG treatment groups(B and C)revealed a prolonged the mice survival time of burden swimming test, hypoxia tolerance, running wheel time and the ability of stick climbing(P<0.05 orP<0.01), and increased LDH activity and MG and LG contents, reduced contents of BLA and BUN. High dose group had an obviously increase effect than lower dose group(P<0.05). Conclusion: EGCG has significant effects against exercise-induced fatigue in mice.

EGCG； exercise-induced fatigue； antagonism; rats

中央高校基本科研业务费资助项目(CQDXWL-2012-100)

2014-06-23 【修回日期】2014-10-15

G804.2

A

1000-6834(2015)01-085-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.025

△【通讯作者】Tel: 13658362808; E-mail: hcy@cqu.edu.cn