PPAR-α对心肌肥大的调控作用及与PI3K/Akt/mTOR通路的关系*

吴 扬， 王宝霞， 郭媛媛， 王玉琴

(南通大学航海医学研究所， 江苏 南通 226019)



PPAR-α对心肌肥大的调控作用及与PI3K/Akt/mTOR通路的关系*

吴 扬△， 王宝霞， 郭媛媛， 王玉琴

(南通大学航海医学研究所， 江苏 南通 226019)

目的：研究过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)对心肌细胞肥大的调控作用及其与PI3K/ Akt /mTOR通路的关系。方法：异丙肾上腺素(ISO)诱导心肌细胞肥大；Leica图像分析软件测量心肌细胞表面积；qRT-PCR方法检测心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、PPAR-α mRNA表达； Western blot检测Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、P70S6K蛋白表达；PPAR-α RNAi抑制PPAR-α的表达。结果：①心肌细胞肥大时，PPAR-α表达显著下降；非诺贝特(Feno)可上调PPAR-α表达，抑制心肌细胞肥大；Feno对心肌细胞肥大的抑制效应可被PPAR-α RNAi所逆转；②Feno能明显抑制ISO诱导的心肌细胞p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达的增加；Feno 的上述作用可被PPAR-α RNAi所逆转；③PI3K抑制剂LY294002 (LY) 或mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)均能明显抑制心肌细胞肥大，LY或RAPA抑制心肌细胞肥大的效应均可被PPAR-α RNAi所取消。结论：PPAR-α通过负性调控抑制心肌细胞肥大。PPAR-α抑制心肌细胞肥大的作用可能与其抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

PPAR-α；PI3K/Akt/mTOR通路；心肌细胞肥大；大鼠

过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator activated receptor-α，PPAR-α)是一种配体依赖的核转录因子。PPAR-α在心肌中的表达较高，对细胞生长、分化、心血管氧化应激和炎性反应具有调节作用[1]。近年来有研究报道[2]，PPAR-α对心肌肥大也具有调控作用。然而其作用机制和信号转导通路迄今尚未完全阐明。由于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)处于生长调节的中心环节而备受关注。有学者提出[3]，mTOR可能是一些与心肌肥大相关信号通路的共同关键调控因子。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也称作蛋白激酶B(proein kinase B,PKB)，是磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)下游靶点, 而mTOR则是PI3K/Akt通路下游的重要因子。mTOR可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控细胞分裂、促进转录和翻译，控制蛋白质合成，调节细胞生长。近年来一些研究已证实PI3K/Akt/mTOR信号通路在心肌肥大的发生发展中起着重要的作用[4]。但是PPAR-α是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控心肌肥大国内外鲜有文献报道。本研究应用PPAR-α激动剂上调其表达，或应用RNAi下调PPAR-α的表达，观察其对心肌细胞肥大的影响，以及与PI3K/Akt/mTOR信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO，Sigma公司) 、 非诺贝特(Fenofibrate，Feno，Sigma公司)、Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)、PPAR-αRNAi干扰序列(吉玛生物技术有限公司)、β-actin单克隆抗体 (Sigma公司)、抗兔单克隆抗体 Akt、P70S6K、mTOR(Cell Signaling Technology Inc 公司)。

1.2 心肌细胞培养

新生1～3 d SD大鼠(南通大学动物中心提供)，取心脏置预冷的D-Hanks液中，将心室肌切碎约1 mm3、加入0.125%胰酶搅拌消化。弃上清，细胞移至15%小牛血清DMEM培养液中孵育。将细胞接种于无菌培养皿中，于5%CO2、饱和湿度的37℃培养箱中放置2 h。孵育后,加入Brdu使其终浓度为0.1 mmol/L。细胞计数后接种于6孔培养板。培养48 h后，换无血清DMEM培养基，24 h后加入干预因素[5]。

1.3 心肌细胞表面积测定

心肌细胞加ISO持续作用48 h后，在相差显微镜下拍照，每孔取10个视野，每个视野约20个细胞。采用Leica图像分析系统，标尺测量细胞表面积，取平均值。

1.4 心肌细胞蛋白含量测定

将6孔板贴壁培养的心肌细胞用3 ml 0. 25%胰酶处理使其脱落悬浮, 用细胞计数仪测定细胞数，一个样本的细胞数约为(8～9)×105。用BCA法测定心肌细胞总蛋白含量。

1.5 RNA提取和qRT-PCR

样品总RNA提取采用TRIzol试剂盒，按试剂盒说明书步骤提取总RNA。逆转录和实时定量PCR(qRT-PCR)实验按说明书步骤进行。根据目的基因与内参基因的Ct值求得各样本目的基因表达水平。

1.6 Western blot检测

提取各组心肌细胞总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。10% SDS-PAGE分离，PVDF膜印迹。室温封闭2h，加入一抗Akt、P70S6K 、mTOR(或β-actin)，4℃过夜，然后加入辣根过氧化物酶HRP标记的二抗孵育2 h。ECL化学发光显色，X光片显影、定影。将胶片进行扫描或拍照，美国UVP公司GDS8000摄取图像，Image J分析软件对条带进行定量分析。

1.7 siRNA 干扰实验

将三对干扰序列PPAR-α-429，PPAR-α-755，PPAR-α-1539合并转染至心肌细胞，其干扰率达70%～75%。将心肌细胞接种于24孔板中，在无抗生素含15%小牛血清DMEM培养基中培养，转染前一天更换无抗生素、无血清的DMEM培养基，饥饿细胞24 h。应用Lipofectamine 2000将干扰序列转染至心肌细胞。转染24 h后换正常培养基，加入ISO诱导心肌细胞肥大，继续培养24 h用于检测。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 PPAR-α在心肌细胞肥大中的作用

分别应用PPAR-α 激动剂非诺贝特(Feno)上调PPAR-α表达或应用RNAi下调PPAR-α表达，观察心肌细胞PPAR-α表达的变化以及PPAR-α对心肌细胞肥大的影响。实验分组：(1)对照组, (2)Feno组, (3)Feno+ISO组, (4)ISO组, (5)negtive RNA+ISO，(6)RNAi+ISO组，(7)Feno+RNAi+ISO组。结果显示：与对照组相比，ISO组PPAR-α表达明显下降。与ISO组比较，Feno+ISO组PPAR-α表达明显增加，而RNAi+ISO组PPAR-α表达下降更明显。与Feno+ISO组比较，Feno+RNAi+ISO组PPAR-α表达明显降低(P<0.01，图1)。

与对照组相比，ISO组心肌细胞表面积、蛋白含量、心肌肥大标志基因心房钠尿肽 (atrial natriuretic peptide，ANP)、β-肌球蛋白重链 (β-myosin heavy chain，β-MHC)表达均显著增加。与ISO组相比，Feno+ISO组上述指标均明显下降，而RNAi+ISO组则均明显增加(P<0.05，P<0.01)。Feno+RNAi+ISO组与Feno+ISO组相比，上述各指标均显著增加(P<0.05，P<0.01，图2)。结果提示，激活PPAR-α能显著抑制ISO诱导的心肌细胞肥大，PPAR-α RNAi可逆转Feno抑制心肌细胞肥大的作用。

2.2 PPAR-α对心肌细胞肥大的影响及与PI3K/Akt/mTOR通路的关系

2.2.1 Feno或PPAR-α RNAi对心肌细胞Akt、mTOR、P70S6K表达的影响 分别应用PPAR-α激动剂Feno或PPAR-α RNAi使PPAR-α表达上调或下调，观察其对心肌细胞p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K蛋白表达的影响。结果显示：与对照组相比，ISO组、Feno+RNAi+ISO组Akt、mTOR、P70S6K蛋白表达均明显增高(P<0.01)。与ISO组相比，Feno+ISO组Akt、mTOR、P70S6K表达均明显降低。与Feno+ISO组相比，Feno+RNAi+ISO组p-Akt 、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均明显增加(P<0.01，图3) 。

2.2.2 PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂雷帕霉素对心肌细胞肥大的影响 分别应用PI3K抑制剂LY294002(LY)或mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)，观察其对ISO诱导的心肌细胞表面积、蛋白含量、以及ANP和β-MHC mRNA表达的影响；并应用PPAR-α RNAi沉默PPAR-α 表达，观察其对心肌细胞肥大的影响。实验分组：(1)对照组，(2)LY组，(3)RAPA 组，(4)ISO组，(5)LY+ISO组，(6)RAPA+ISO组，(7)RNAi +LY +ISO组，(8)RNAi +RAPA +ISO组。结果显示，LY +ISO组、RAPA+ISO组分别与ISO组相比，心肌细胞表面积、蛋白含量、ANP和β-MHC mRNA表达水平均明显减少。RNAi+LY+ISO组与LY+ISO组、RNAi+RAPA+ ISO组与RAPA+ISO组相比，心肌细胞表面积、蛋白含量、ANP和β-MHC mRNA表达水平均明显增加(图4，P<0.05，P<0.01)。实验结果提示LY或RAPA均可明显抑制ISO诱导的心肌细胞肥大，LY或RAPA抑制心肌细胞肥大的作用均可被PPAR-α RNAi所逆转。

2.2.3 LY294002或雷帕霉素对心肌细胞p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达的影响 分别应用PI3K抑制剂LY或mTOR抑制剂RAPA观察其对各自下游分子的抑制作用；并应用PPAR-α RNAi沉默PPAR-α 表达，观察其对PI3K/Akt/mTOR通路的影响。结果显示， ISO组与对照组相比，心肌细胞内p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均明显增高(P<0.05，P<0.01)。LY+ISO组与ISO组比较，p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均显著降低。RAPA+ISO组与ISO组比较p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均显著降低。RNAi+LY+ISO组与LY+ISO组相比，p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均明显增高。RNAi+RAPA +ISO组与RAPA+ISO组相比p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均明显增高(图5)。

3 讨论

心肌肥大是心肌对多种心血管刺激的适应性反应，是高血压病的常见并发症。持续的心肌肥大可导致心律失常、心衰甚至猝死，被认为是心血管疾病发病率和死亡率增高的独立危险因素[6]。然而迄今为止，关于心肌肥大的病理机制及其信号转导机制仍未完全阐明。目前对心肌肥大的研究热点主要集中在细胞核内基因表达、细胞内外的信号转导通路等方面。细胞内的信号转导通路是胞外刺激与核内基因活化的偶联环节，对心肌肥大的发生发展起着至关重要的作用。

本研究采用ISO诱导心肌细胞肥大，观察在ISO诱导心肌细胞肥大过程中PPAR-α的表达水平变化。结果表明在ISO诱导的心肌细胞肥大中，PPAR-α mRNA的表达明显下降。这与相关文献的报道是一致的[7]。为了进一步探讨PPAR-α在心肌肥大中的作用，本研究分别应用PPAR-α激动剂Feno上调PPAR-α的表达，或应用PPAR-α RNAi特异性干扰PPAR-α的表达，观察对心肌细胞肥大的影响。结果发现Feno上调PPAR-α表达能明显抑制ISO诱导的心肌细胞表面积、蛋白含量、以及ANP和β-MHC mRNA表达水平的增加。应用PPAR-α RNAi沉默PPAR-α的表达，则加强了ISO诱导的心肌细胞肥大效应，并且逆转了Feno对心肌细胞肥大的抑制作用。研究结果表明，激活PPAR-α可抑制ISO诱导的心肌细胞肥大反应。

业已证明，PI3K/Akt信号通路参与心肌肥大的的发生发展过程。一些生物活性物质通过激活PI3K/Akt，进一步引起下游mTOR的活化[3、8]。活化的mTOR主要通过下游分子p70S6K促进细胞生长。mTOR抑制剂RAPA则通过特异性抑制mTOR激酶活性，抑制mTOR/p70S6K信号通路的激活，从而抑制细胞蛋白的合成。近年来有文献报道[4、9]，在心肌肥大发生发展过程中mTOR具有极其重要的调节作用，血管紧张素-Ⅱ,内皮素-1等均可通过PI3K/Akt通路激活mTOR，促进心肌肥大。在应用RAPA对小鼠进行在体实验发现，当小鼠左心室压力超负荷造模前使用RAPA可明显降低心肌肥大的程度。鉴于国内外相关文献报道，我们推测PPAR-α负性调控心肌肥大的作用有可能与PI3K/Akt/mTOR通路相关。为了验证两者的关系，本研究分别应用Feno或PPAR-α RNAi上调或下调PPAR-α的表达，观察ISO诱导的心肌细胞p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达的变化。结果发现，ISO刺激能使心肌细胞p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达明显增加。应用Feno上调PPAR-α表达可明显抑制ISO诱导的p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达的增加。应用PPAR-α RNAi特异性沉默PPAR-α的表达，不仅明显增强ISO诱导的p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达，而且PPAR-α RNAi还可逆转Feno对心肌细胞p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达的抑制作用。研究表明Feno对心肌细胞肥大的抑制作用具有PPAR-α依赖性，激活PPAR-α可负性调控ISO诱导的心肌细胞肥大，其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

为了进一步探讨PPAR-α负性调控心肌细胞肥大作用与PI3K/Akt/mTOR信号通路的关系，本研究分别应用PI3K抑制剂LY或 mTOR抑制剂RAPA预处理ISO诱导的心肌细胞，观察对心肌细胞肥大和PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达的影响。结果表明LY或RAPA均能明显抑制ISO诱导的心肌细胞表面积、蛋白含量、以及ANP和β-MHC表达的增加。ISO刺激能使心肌细胞p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达明显增加。LY或RAPA均可显著抑制ISO诱导的p-Akt、p-mTOR及p-p70S6K蛋白表达的增加。LY或RAPA的上述作用均可被PPAR-αRNAi所取消。实验结果进一步证明PPAR-α是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制心肌细胞肥大。

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The effect of relgulation of PPAR-α on cardiac hypertrophy and the relationship between the effect of PPAR-α with PI3K/Akt/mTOR pathway

WU Yang△, WANG Bao-xia, GUO Yuan-yuan, WANG Yu-qin

(Institute of Navigation Medicine, Nantong University, Nantong 226001, China)

Objective: To investigate the effect of peroxisiome proliferator activated receptor-α(PPAR-α) on the regulation of cardiomyocyte hypertrophy and the relationship between the effect of PPAR-α with PI3K/Akt//mTOR signal pathway. Methods: Cardiomyocyte hypertrophy was induced by isoproterenol (ISO). The cell surface area was measured by image analysis system (Leica). The expressions of atrial natriuretic peptide (ANP) , β-myosin heavy chain(β-MHC) and PPAR-α mRNA were detected by qRT-PCR. The protein expressions of Akt, mTOR and P70S6K were detected by Western blot. The expression of PPAR-α was suppressed by RNAi. Results: ①The expression of PPAR-α was significantly reduced in cardiomyocyte hypertrophy. PPAR-α activator Fenofibrate (Feno) increased the expression of PPAR-α and suppressed cardiomyocyte hypertrophy. The inhibitory effect of Feno on cardiomyocyte hypertrophy was reversed by PPAR-α RNAi. ②Feno significantly inhibited the increase of the protein expressions of p-Akt, p-mTOR and p-p70S6K in ISO induced cardiomyocyte hypertrophy, which could be blocked by PPAR-α RNAi. ③PI3K antagonist LY294002 (LY) or mTOR antagonist rapamycin (RAPA) markedly inhibited cardiomyocyte hypertrophy. The inhibitory effects of LY or RAPA on cardiomyocyte hypertrophy were reversed by PPAR-α RNAi. Conclusion: PPAR-α can negatively regulate cardiomyocyte hypertrophy. The effect might be associated with PPAR-α inhiting PI3K/ Akt/mTOR signal pathway.

PPAR-α； PI3K/Akt/mTOR pathway； cardiomyocyte hypertrophy； rat

2014-09-01

2015-03-04

R331

A

1000-6834(2015)03-284-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.025

△【通讯作者】Tel: 13906292310； E-mail： wy@ntu.edu.cn