蜂胶总黄酮对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制*

王海华， 曾 瑾， 王海珍， 姜玉新， 王 静， 周萍萍

(皖南医学院生理教研室， 安徽芜湖 241002)



蜂胶总黄酮对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制*

王海华△， 曾 瑾， 王海珍， 姜玉新， 王 静， 周萍萍

(皖南医学院生理教研室， 安徽芜湖 241002)

目的：探讨蜂胶总黄酮(TFP)对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响及其可能机制。方法：随机选取6只雄性SD大鼠为正常对照(NC)组；余下大鼠采用腹腔注射阿霉素造模，将造模成功的大鼠随机分成5组(n=6)：慢性心力衰竭模型(CHF)组、蜂胶总黄酮低剂量(LD)组、蜂胶总黄酮中剂量(MD)组、蜂胶总黄酮高剂量(HD)组和地高辛(DIG)组。6周后通过生物信号系统记录大鼠血流动力学相关指标；检测各组大鼠血浆中脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)含量；取材后HE和Masson染色观察心脏结构改变及胶原纤维增生情况；Western blot检测缝隙连接蛋白43(P-Cx43)表达水平；TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果：与NC组相比，CHF组大鼠心脏血流动力学指标左室峰压(LVSP)及左室内压变化速率(±dP/dtmax)绝对值明显下降(P<0.01)，左室舒张期末压(LVEDP)明显升高(P<0.01)；血浆中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量均明显升高(P<0.01)；与CHF组相比， MD、HD组大鼠心脏血流动力学指标LVSP和±dP/dtmax绝对值明显升高(P<0.05)，LVEDP明显降低(P<0.01)，LD组LVEDP明显降低(P<0.01)，LVSP和±dP/dtmax变化均不明显。MD、HD组大鼠血清中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量明显降低(P<0.01)，LD组各指标变化不明显；Western blot结果显示:与NC组相比，CHF组P-Cx43条带明显增粗，给予TFP灌胃后，随着TFP剂量的增加，TFP各组P-Cx43条带逐渐变细变淡；进一步半定量分析显示，与NC组相比，各组中P-Cx43表达量显著升高(P<0.01)；与CHF组相比，TFP各组P-Cx43表达量均降低；MD组P-Cx43表达量低于LD组(P<0.01)，高于HD组(P<0.05)；CHF组心肌细胞凋亡指数(%)(22.61±3.39)较NC组(1.12±0.24)明显增高(P<0.01)；与CHF组相比，蜂胶总黄酮LD、MD、HD组心肌细胞凋亡指数(%)分别为(15.79±2.80)、(9.28±2.10)、(4.73±1.14)均明显低于CHF组(P<0.01)；大鼠心肌组织P-Cx43表达水平与心肌细胞凋亡指数呈显著正相关(P<0.01)。结论：蜂胶总黄酮呈剂量依赖性对阿霉素诱导的大鼠慢性心力衰竭心肌细胞凋亡具有抑制作用，其机制可能与Cx43表达调控特别是磷酸化状态的调控密切相关。

心力衰竭； 蜂胶总黄酮；缝隙连接通道；连接蛋白43；大鼠

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)已成为危害人类身心健康的主要疾病之一[1]，其发病机制复杂，心肌细胞凋亡在其发生发展中起重要作用，神经内分泌[2,3]的活动也与CHF时心肌细胞凋亡关系密切[4]。连接蛋白43(connexin 43,Cx43)构成心肌细胞间缝隙连接(gap junction, GJ)通道，磷酸化和去磷酸化是心肌细胞膜上Cx43存在的两种状态，对GJ通道的功能起调控作用。梁庆等[5]报道CHF时磷酸化的缝隙连接蛋白43(P-Cx43)的含量升高，可能与GJ通道关闭，Cx43降解增加，从而影响细胞间信号转导[5-7]有关。

蜂胶是蜜蜂采集植物幼芽分泌物和树脂等并混入其上颚腺分泌物混合加工而成的一种胶状物，无毒副作用，其主要成分是黄酮类化合物(total flavonoids of propolis,TFP)[8]，具有抗氧化、心肌保护及抗肿瘤等作用，有“紫色黄金”的美誉[9-11]。有关蜂胶对CHF过程中心肌损伤作用及其可能机制，尚未见报道。本实验通过阿霉素(adriamycin,ADR)诱导复制CHF大鼠模型[12]，通过蜂胶总黄酮灌胃给药，检测大鼠心功能、血浆肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、血浆脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)及心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)含量等指标，经HE和Masson染色观察大鼠心肌形态学变化及胶原纤维增生情况，Tunel法检测心肌细胞凋亡和Western blot法检测P-Cx43表达，旨在探讨蜂胶总黄酮对CHF的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

盐酸阿霉素(德国Ruibio公司，RD7121)，用0.9%氯化钠注射液溶解盐酸阿霉素[13]，按每只大鼠2 mg/kg的剂量溶于1 ml生理盐水。地高辛片(上海信谊药厂有限公司，H31020678)，取地高辛片，用0.9%氯化钠注射液配制成混悬液，按每只大鼠0.02 mg/kg 的剂量溶于1 ml生理盐水。水溶性蜂胶(总黄酮14.7%，广州市杰禾蜂业有限公司，批号：20121103-A)。

1.2 主要仪器与试剂

Medlab-U/8c生物信号采集分析系统(南京美易公司)；倒置荧光显微镜及照相系统(日本Olympus公司)；Model-680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)；DYY-7C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；紫外可见分光光度计(UV-3200PCS)；BECKMAN COULTER 微量台式离心机(microfuge 22R centrifuge)；BNP酶联免疫检剂盒、辣根过氧化物酶标记(horseradish peroxidase labeled, H+L)山羊抗兔IgG、(rabbit-anti-glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)Rabbit-Anti-GAPDH、cTnI酶联免疫试剂盒、TNF-ɑ及IL-6试剂盒(合肥博美生物科技有限公司)；Masson三色染色液(Beijing Leagene Biotechnology Co.,Ltd)；Tunel细胞凋亡检测试剂盒(显色法)(碧云天生物技术研究所)；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 实验动物及分组

雄性SD大鼠，体重(200±20)g，由合肥蜀山实验动物中心提供[合格证号：SC×K(苏)2009-0001]，适应性喂养一周。随机选6只大鼠为正常对照组(NC组)，模型组(CHF 组)大鼠通过腹腔注射阿霉素2 mg/kg，每周相同时间点注射1次，连续6周[13]，复制大鼠心力衰竭模型成功后，随机将其分成蜂胶总黄酮低剂量组(LD 组)、蜂胶总黄酮中剂量组(MD 组)、蜂胶总黄酮高剂量组(HD组)和地高辛组(DIG 组)(n=6), 通过腹腔注射阿霉素2 mg/kg，每周相同时间点注射1次，连续6周，在第3次注射后，每日相同时间点分别以1 ml(以总黄酮含量为50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg)及0.02 mg/kg地高辛[14]对大鼠灌胃给药，持续4周，分别为(LD组、MD组和HD组)和DIG 组，NC组和CHF组大鼠在每天相同时间点灌胃等容积的生理盐水，其他步骤相同。

1.4 大鼠心功能检测及样本制备处理

6周后，通过生物信号系统检测大鼠血流动力学指标，包括心率(heart rate,HR)、左室峰压(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒张期末压(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)及左室内压变化速率(maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure,±dp/dtmax)，稳定15 min后，连续记录30 min，取均值；完成后，由颈总动脉取血，冷冻高速离心(3 000 r/min)10 min，取上清，-20℃分装保存，用于生化指标检测；称取并计算大鼠心重/体重比值(heart weight/body weight,HW/BW)，留取大鼠心室的心尖部及心底部，心尖部用于Western blot检测；心底部4%多聚甲醛固定，通过HE和Masson染色观察其形态学及胶原纤维增生情况。

1.5 Western blot半定量检测P-Cx43表达

测定大鼠心尖部左心室总蛋白质浓度，每孔加入50 μg的总蛋白质，进行SDS-PAGE(10%的分离胶)电泳，电转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h。1∶400 P-Cx43兔抗鼠多克隆抗体[购自英国艾博抗贸易有限公司，Abcam上海办事处(phospho S368)antibody ab30559],4℃孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗(1∶2 000)室温下孵育2 h，以GAPDH(1∶2 000)抗体作内参照。洗膜后ECL试剂显影。

1.6 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

通过TUNEL检测试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)检测各组大鼠心肌组织中的凋亡细胞。光镜下正常细胞核显蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一棕黄色(TUNEL阳性)。每只大鼠观察4张切片，每张切片上随机选取计数5个视野(×400)，计算每个视野内凋亡阳性细胞核数占总细胞总数百分比，取其平均值为心肌细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 蜂胶总黄酮对大鼠血流动力学的影响

大鼠血流动力学指标显示，与NC组相比，CHF组大鼠心脏LVSP及±dP/dtmax绝对值明显下降(P<0.01)，LVEDP明显升高(P<0.01)；与CHF组相比， MD、HD及DIX组大鼠LVSP和±dP/dtmax绝对值明显升高(P<0.05)，LVEDP明显降低(P<0.01)，LD组LVEDP明显降低(P<0.01)，LVSP和±dP/dtmax变化均不明显；同LD组相比，MD、HD及DIX组大鼠LVSP和±dP/dtmax绝对值明显升高(P<0.05，P<0.01)，LVEDP明显降低(P<0.01，表1)。

Tab.

HR：Heart rate； LVSP： Left ventricular systolic pressure； LVEDP： Left ventricular end diastolic pressure； ±dP/dtmax： Maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure； NC： Normal control group; CHF: Chronic heart failure group; LD: Low does group; MD: Middle dose group; HD: High dose group; DIG: Digoxin group

**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsCHF group;△P<0.05，△△P<0.01vsLD group

2.2 大鼠血浆中BNP、cTnI、TNF-α和IL-6含量及心脏重量/体重(HW/BW)比值的组间变化

同NC组相比，其余组大鼠血浆中BNP、TNF-α及IL-6含量均增加(P<0.05，P<0.01)，大鼠血浆中cTnI含量在CHF、LD及MD组高于NC组(P<0.01)，HD与DIG组与之差异不明显；与CHF组相比，MD、HD及DIG组大鼠血浆中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量均减小(P<0.01)，LD组变化不明显；BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量在MD、HD和DIG组较LD组显著减小(P<0.05，P<0.01)；HD和DIG组大鼠显著低于MD组(P<0.05，P<0.01)；与NC组相比，CHF和LD组大鼠HW/BW显著增大(P<0.05)，其余各组变化不明显；与CHF组相比，HD和DIG组显著减小(P<0.05,P<0.01)，LD和MD组与之差异不明显。与LD组相比，HD和DIG组大鼠HW/BW显著减小(P<0.05,P<0.01，表2)。

2.4 各组大鼠心肌通过HE染色观察形态学变化

心肌HE染色可见：NC组大鼠心肌细胞形态正常，结构清晰，排列整齐，无心肌纤维的破坏，间质无明显增生(图1A)；CHF组心肌细胞受损，心肌纤维排列紊乱，部分心肌纤维溶解断裂，心肌细胞间隙明显增宽(图1B)；各TFP组情况较CHF组改善，且随着TFP剂量的增加，有渐好趋势(图1C、D、E)；DIG组心肌纤维排列不规整，心肌细胞微肿胀(图1F，见彩图页Ⅰ)。

Tab.

BNP： Brain natriuretic peptide; cTnI： Cardiac troponin I; TNF-α： Tumor necrosis factor-α; IL-6： Interleukin-6

*P<0.05，**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsCHF group;△P<0.05，△△P<0.01vsLD group；▲P<0.05，▲▲P<0.01vsMD group

2.5 Masson染色心肌胶原纤维结果

Masson染色下心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。Masson染色结果显示：NC组无明显胶原沉积(图2A)；CHF组有较多蓝色心肌胶原沉积于心肌细胞周围(图2B，见彩图页Ⅰ)，心肌细胞胶原容积分数(CVF)为(17.18±4.49)%明显高于NC组(5.57±3.57)%(P<0.01)，LD、MD、DIG组CVF%分别为(15.56±4.40)、(11.19±2.60)、(11.55±2.94)均明显高于NC组(P<0.01)，HD组CVF为(7.10±1.83)%与NC组差异无统计学意义；与CHF组相比，MD、HD、DIG组CVF明显减小(P<0.01，图3)。

2.6 Tunel法检测心肌细胞凋亡

Tunel染色下正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕黄色。Tunel染色结果可见：NC组心肌细胞凋亡阳性染色很少(图4A)，CHF组大鼠心肌细胞Tunel染色阳性细胞核显著增多(图4B，见彩图页Ⅰ)。与NC组心肌细胞凋亡指数(%)(1.12±0.24)相比，CHF、LD、MD、HD、DIG各组心肌细胞凋亡指数(%)分别为(22.61±3.39)、(15.79±2.80)、(9.28±2.10)、(4.73±1.14)、(7.26±1.43)明显高于NC组(P<0.01)；LD、MD、HD、DIG组心肌细胞凋亡指数(%)均低于CHF组(P<0.01)；MD、HD、DIG组心肌细胞凋亡指数(%)低于LD组(P<0.01)，且HD低于MD组(P<0.01，图5)。

2.7 Western blot法检测各组大鼠左心室P-Cx43表达结果

P-Cx43条带在分子量43kD处清晰表达(图6)。与NC组相比，CHF组P-Cx43条带明显增粗，给予TFP灌胃后，随着TFP剂量的增加，TFP各组P-Cx43条带逐渐变细变淡，DIG组P-Cx43条带较NC处粗，较CHF组变细。进一步半定量分析显示，与NC组相比，各组中P-Cx43表达量显著升高(P<0.01)；与CHF组相比，TFP各组P-Cx43表达量均降低(P<0.05,P<0.01)，DIG组P-Cx43表达量较CHF组显著降低(P<0.01)；MD组P-Cx43表达量低于LD组(P<0.01)，但高于HD组(P<0.05)，与LD组相比，MD、HD及DIG组P-Cx43表达量明显减少(P<0.05,P<0.01)。

2.8 大鼠心肌细胞P-Cx43表达水平与凋亡程度的相关性分析

Pearson直线相关分析显示，P-Cx43/GAPDH吸光度值与心肌细胞凋亡指数呈明显的正相关(P<0.01，图7)。

Fig. 7 Optical density ratio (P-Cx43/GAPDH) and myocardial apoptotic index were positively correlated

3 讨论

慢性心力衰竭是常见的危重症之一，其发病机制复杂，研究认为与心室重构、神经内分泌系统、各种体液因子等有关[15-17]，寻求防治CHF的方法是目前亟待解决的课题。

蜂胶的主要有效成分是蜂胶总黄酮，具有舒张血管、清除血管内壁积存物、改善血管弹性和渗透性，增强心肌收缩力，抑制血小板积聚等作用[18]。有关蜂胶对阿霉素所致大鼠慢性心力衰竭的研究尚未见报道。本实验通过腹腔注射阿霉素诱导复制大鼠CHF模型[12]，通过蜂胶总黄酮灌胃对大鼠给药，旨在探讨其对慢性心衰大鼠的作用及其可能作用机制。

BNP是由左心室心肌细胞分泌的一种肽类激素，当出现心功能衰竭时，血浆脑钠肽水平明显升高[19]。心肌肌钙蛋白(cTn)广泛分布于心肌与骨骼肌中，有三种不同的亚单位：cTnI、cTnT和cTnC，分别由不同的基因编码，有不同的结构和作用，而cTnI是心肌细胞特有的亚型，具有高度的心肌特异性，故cTnI是一种高灵敏度、高特异性的心肌损伤的标志物[20]。肿瘤坏死因子(TNF-α)在CHF病理生理过程和发病机制中起重要的作用，TNF-α可作为CHF发生的独立预测因子，在心衰过程中，其可能参与诸如心肌抑制、血管扩张、促进左室重构及心肌纤维化等病理进程[21]。IL-6在CHF患者血中表达增加，与CHF严重程度紧密相关[22]。细胞凋亡是在基因调控下的细胞主动死亡，因此又称为程序化细胞死亡。Caspase家族是参与调节和执行凋亡最重要的蛋白酶之一，Caspase 3是其家族中最重要的成员，是控制细胞凋亡发生及发展的标志酶[23]。文献报道，心肌细胞凋亡的增加与CHF的发生发展有着密切的关联[24]。已有研究表明，CHF时磷酸化的P-Cx43的含量是升高的[5]，心肌细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)磷酸化与去磷酸化的水平调控，在心肌细胞中的电耦联及化学信息交流中起着非常重要的作用。

心功能指标LVSP及+dp/dtmax反映心肌收缩功能，其值越大表明心肌收缩功能越好，-dp/dtmax反映心肌舒张功能，其绝对值越大，心肌舒张功能越好，LVEDP是反应心室泵血过程中的前负荷，在正常范围内，其值越低，反应心肌舒张功能越好[25]。

本实验结果显示，CHF组大鼠心肌收缩及舒张功能明显低下，LVSP及±dp/dtmax绝对值明显降低，LVEDP明显升高，血浆中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量也明显增高，HW/BW比值明显增大，心肌HE及Masson染色结果显示，心肌细胞受损明显，心肌细胞胶原容积分数显著增高，心肌细胞Tunel染色阳性细胞核亦显著增多；左室肌P-Cx43表达增多与心肌细胞凋亡呈明显的正相关，同NC组大鼠相比有显著性差异；而同CHF组相比，MD、HD及DIG组大鼠心脏LVSP及±dp/dtmax绝对值升高明显，LVEDP降低明显，血浆中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量亦显著降低，HW/BW比值降低明显，HE及Masson染色亦表明，心肌细胞损伤减轻，心肌细胞胶原容积分数降低，心肌细胞Tunel染色阳性细胞核亦显著减少，左室肌P-Cx43表达减少与心肌细胞凋亡具有一致性，差异有显著性。

综上所述，TFP呈剂量依赖性改善慢性心衰大鼠的心功能，抑制心室重构、减轻心肌细胞纤维化，对阿霉素心肌损伤具有明显的保护作用，减轻心肌细胞凋亡，其机制可能与Cx43表达调控特别是磷酸化状态的调控密切相关。

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Effects of total flavonoids of propolis on apoptosis of myocardial cells of chronic heart failure and its possible mechanism in rats

WANG Hai-hua△, ZENG Jin, WANG Hai-zhen, JIANG Yu-xin, WANG Jing, ZHOU Ping-ping

(Department of Physiology, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

Objective: To investigate the effects of total flavonoids of propolis(TFP) on apoptosis of myocardial cells of chronic heart failure and its possible mechanism in rats. Methods: Six male SD rats were randomly selected as normal control group,the remaining rats were made as chronic heart failure (CHF) model by intraperitoneal injection of adriamycin. The rats in the successful model were randomly divided into five groups (n=6): CHF group, total flavonoids of propolis low dose group(LD group), total flavonoids of propolis middle dose group(MD group), total flavonoids of propolis high dose group(HD group),digoxin group(DIG group).After six week treatment, cardiac function indexes of rats were recorded by signal acquisition system;brain natriuretic peptide(BNP),cardiac troponin I(cTnI),tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-6(IL-6) content in plasma were detected; Myocardial morphological changes and collagen fiber hyperplasia by HE and Masson staining were observed; Myocardial apoptosis was detected with TUNEL method and protein connexin 43(P-Cx43) expression was detected by Western blot method. Results: Compared with NC group, left ventricular systolic pressure(LVSP) and maximal rise/fall velocity of left ventriculad pressure(±dP/dtmax)absolute value in CHF group were significantly lowered (P<0.01) while left ventricular end diastolic pressure(LVEDP) was increased significantly (P<0.01); Contents of plasma BNP,cTnI,TNF-αand IL-6 in the CHF group were significantly improved (P<0.01). Compared with CHF group, LVSP, ±dP/dtmaxabsolute value in MD and HD groups were increased (P<0.05), and LVEDP was significantly lowered (P<0.01); LVEDP in LD group was significantly lowered (P<0.01), changes in LVSP and ±dp/dtmaxabsolue value were not obvious (P>0.05). BNP, cTnI, TNF-α and IL-6 contents in MD and HD groups were significantly reduced(P<0.01), but those plasma indicator changes were not obvious in LD group(P>0.05). Western blot showed that P-Cx43 expression in CHF group was significantly higher than that in NC group(P<0.01)and that in all TFP treatment groups it was decreased compared with CHF group(P<0.05,P<0.01),among which pairwise comparisons also showed differences (P<0.05),myocardial apoptosis index (%)(22.62±3.39) in CHF group was higher than that in NC group(1.12±0.24)(P<0.01);compared with CHF group,the apoptosis index of myocardial cells (%) in LD,MD and HD groups, (15.79+2.8),(9.28+2.1) and (4.73+1.14)respectively, were significantly lower than those in the CHF group(P<0.01). The expression level of P-Cx43 positively correlated with the apoptotic index (r=0.861,P<0.01). Conclusion: Total flavonaids of propolis have inhibitory effect on apoptosis of myocardial cells of chronic heart failure induced by adriamycin in rats, and the mechanism may be closely related to the regulation of Cx43 expression, especially the regulatory phosphorylation status.

chronic heart failure; total flavonaids of propolis; gap junction channel; connexin 43; rats

国家自然科学基金资助项目(81172790)；安徽省高校省级科学研究重点项目(KJ2013A251)；安徽省2012年省级教学研究重点项目(2012jyxm313)

2014-12-05

2015-02-11

R73-3

A

1000-6834(2015)03-201-06

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.003

△【通讯作者】Tel： 13675536187； E-mail: wanghaihua9972@sina.com