颅脑创伤后的化学微环境对温敏脐带间充质干细胞增殖和分化的影响*

赵明亮， 陈以胜， 李晓红， 王景景， 涂 悦， 孙洪涛， 张赛， 陈 羽中,3△

(1. 武警后勤学院附属医院神经生物细胞治疗科, 2. 脑创伤及神经疾病研究所， 天津市神经创伤修复重点实验室, 天津 300162；3. 天津中医药大学研究生部， 天津 300193)



颅脑创伤后的化学微环境对温敏脐带间充质干细胞增殖和分化的影响*

赵明亮1,2， 陈以胜2， 李晓红2， 王景景2， 涂 悦2， 孙洪涛2， 张赛2， 陈 羽中2,3△

(1. 武警后勤学院附属医院神经生物细胞治疗科, 2. 脑创伤及神经疾病研究所， 天津市神经创伤修复重点实验室, 天津 300162；3. 天津中医药大学研究生部， 天津 300193)

目的：模拟颅脑创伤(TBI)后的化学微环境，探讨损伤组织提取液对温度敏感型脐带间充质干细胞(tsUC)增殖和分化影响。方法：用液压冲击损伤仪建立大鼠颅脑创伤模型，获取损伤区域脑组织的匀浆液，用于模拟TBI后的化学微环境。分离培养人脐带间充质干细胞(UC)，通过感染携温度敏感型猿猴病毒40大T抗原(ts-SV40LT)基因的逆转录病毒，以建立tsUC系。在模拟脑组织弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶上进行细胞培养。实验分为UC组(37℃，加入PBS)、tsUC组(33℃，加入PBS)、UC+提取液组(37℃)、tsUC+提取液组(33℃ 持续3 d，后转至37℃)(n=4)。动态观察各组细胞的生长情况和形态变化，24 h后检测细胞的凋亡水平，3 d检测细胞的增殖情况，7 d检测其向神经元和星形胶质细胞分化的水平。 结果：与UC+提取液组相比，tsUC+提取液组的凋亡细胞和增殖率分别显著性减少和增加(P<0.01)；细胞免疫荧光结果显示，tsUC+提取液组GFAP和NeuN阳性细胞均比UC+提取液组显著性增加(P<0.01)。结论：在模拟脑损伤的化学微环境中，温敏脐带间充质干细胞联合亚低温可显著逆转脑损伤诱导的细胞凋亡，促进细胞的增殖以及向神经细胞的分化，从体外角度证实了温敏脐带间充质干细胞在亚低温环境下对TBI后脑组织微环境的适应性和耐受性。

颅脑创伤；化学微环境；人脐带间充质干细胞；温敏脐带间充质干细胞；亚低温；脑组织提取物；

微环境的稳定是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件。移植干细胞在目标部位存活且分化为功能细胞是干细胞发挥作用的前提和关键，而影响干细胞行为的决定性因素主要是局部的微环境。微环境包括化学微环境和物理微环境。创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)，简称颅脑创伤，其高致死率和致残率，给社会和家庭带来沉重的负担[1]。TBI后可引起大量炎症因子和自由基的产生与释放、钙离子的内流等化学微环境的改变。研究证实，33℃～35℃低温(亚低温)能显著降低TBI的病死率和改善预后。虽然干细胞移植在TBI 治疗领域有着广阔的应用前景，然而TBI后原发性和继发性损伤所致的化学微环境，不利于移植干细胞的存活和分化，严重降低了干细胞的修复疗效。

本室在前期的实验中成功建立了温度敏感型脐带间充质干细胞(temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells，tsUC)系。该细胞系因表达温度敏感性猿猴病毒40大T(temperature-sensitive Simian 40 Large T-antigen，ts-SV40LT)蛋白而在33℃(亚低温)下的增殖活性最大，而在37℃～39℃正常脑温下停止增殖而转向分化。tsUC 的应用既能扩增干细胞数量以满足临床的需要，又具有横向分化为神经细胞的潜能，同时tsUC最大增殖活性的温度与亚低温治疗的最适温度相契合，因此可能是改善和适应TBI后损伤微环境的理想干细胞。本实验通过用TBI脑组织匀浆模拟TBI后的化学微环境和脑组织的弹性量，探讨tsUC在该环境下的增殖和分化能力，以评估tsUC对TBI损伤微环境的适应能力。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料和试剂

新生儿脐带(由武警后勤学院附属医院妇产科提供，已通过伦理学审查)，胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)，神经元蛋白抗体(NeuN)，Brdu抗体，SV40LT抗体(Abcam， 美国)，荧光标记二抗(Millipore，美国)，Brdu化合物(Sigma，美国)，单丙烯酰胺(Amresco，美国)，双丙烯酰胺(天津市光复精细化工研究所)，I型胶原蛋白(Sigma，美国)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)试剂(天津鼎国生物技术有限责任公司，中国)。

1.2 聚丙烯酰胺水凝胶的制备和检测

聚丙烯酰胺水凝胶是一种无色透明的类似果冻状的液态物质。本实验用其制备的样品硬度近似脑组织。将单丙烯酰胺和双丙烯酰胺按一定比例混合后用PBS缓冲液稀释，并加入过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基二乙胺[2]，通过聚合作用制备弹性模量为0.5 kPa的聚丙烯酰胺水凝胶。然后将200 μl浓度为50 mmol/L的sulfo-SANPAH均匀铺在水凝胶表面，超净台内用紫外进行光活化；最后将0.2 mg/ml的I型胶原蛋白均匀铺在水凝胶表面4℃过夜，Hepes液漂洗之后，将载有聚丙烯酰胺水凝胶的盖玻片置于六孔板中备用。使用前预先用达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle's medium，DMEM)浸泡2 h。

1.3 tsUC的建立与鉴定

将健康新生儿脐带在超净台中用PBS冲洗干净，用剪刀、镊子剔去血管，取出华氏胶，所得组织充分剪碎至1 mm3大小，37℃条件下用胶原蛋白酶处理18 h，之后用1 g/L胰酶消化5 min，用细胞筛过滤后取滤液，即得到原代脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC)。待细胞生长达到60%融合时，用含4 μg/ml聚凝胺的携ts-SV40Lt基因的逆转录病毒悬液对细胞进行感染48 h，并根据前期研究方法对培养细胞进行鉴定[3], 证实为tsUC细胞。将感染成功的tsUC置于33℃培养箱中，其余培养条件同UC。

1.4 TBI模型的建立和损伤组织匀浆液的提取

对12只280～300 g的SD大鼠(由军事医学科学院动物实验中心提供)进行液压冲击制作TBI模型。实验前，将大鼠用5%的异氟烷进行麻醉，而后将其俯卧位固定于立体定向头架上，通过鼻腔持续吸入2%的异氟烷。头部备皮、消毒完毕后，于中线处切开头皮，剥离骨膜暴露右侧顶骨。于冠状缝后3.8 mm、中线旁开2.5 mm处用牙科磨钻磨开直径4.8 mm的骨窗。暴露出完整硬脑膜后，在骨窗处放置塑料打击管，以牙科水泥固定，用液压冲击颅脑损伤仪(Custom Design Fabrication，美国)进行冲击损伤[4,5]，致重度TBI(2.4 atm)。损伤后立即给予小动物呼吸机维持通气，待恢复正常自主呼吸后缝合头皮切口。所有操作均在无菌条件下进行，操作过程采用HP-V26温度测定仪持续监测大鼠的肛温，使之维持在36℃～37℃水平。TBI第3天用5%的异氟烷将大鼠麻醉，经PBS灌流之后断头取全脑，用滤纸吸干脑组织表面。切取右侧损伤区包括周围2 mm 以内的脑组织置于冰袋上，迅速称量湿重。将所有大鼠的脑组织剪碎、混合，并加入DMEM进行匀浆(每150 mg脑组织加入1 ml DMEM)，4℃条件下以1 000 r/min的速度离心10 min后，用孔径为0.2 μm的滤器对上清液过滤除菌，滤液保存于-80℃冰箱中备用[6]。

1.5 实验干预及分组

将UC和tsUC置于弹性模量为0.5 kPa的聚丙烯酰胺水凝胶上，加入含有1%双抗的DMEM及10% FBS的培养液，并按20%体积比添加大鼠脑组织提取液，24 h后更换正常的新鲜培养基。根据所培养细胞及培养温度的不同，将实验分为4组：实验分为UC组(37℃，加入PBS)、tsUC组(33℃，加入PBS)、UC+提取液组(37℃)、tsUC+提取液组(33℃持续3 d，后转至37℃)，各组细胞培养7 d ,细胞密度为2×104cells/ml。

1.6 观察细胞的凋亡水平及形态变化

在倒置相差显微镜(Optic BD200-PH，美国)下观察水凝胶上细胞的生长形态，24 h后取出玻片置于70%酒精中，4℃固定2 h，用10 μg/ml的RNase A对细胞进行处理，继之用50 μg/ml碘化丙啶(PI)染色。将玻片于倒置荧光显微镜(Leica DMI4000B，德国)下观察、摄像。

1.7 免疫荧光法观察细胞的增殖情况

用10 μmol/L的BrdU标记48 h后转至新鲜正常培养基，标记3 d后4%多聚甲醛固定30 min后，进行细胞免疫荧光检测。加入羊抗大鼠BrdU一抗和荧光标记的二抗，并用DAPI进行细胞核染色，比较各组细胞的增殖情况。

1.8 免疫荧光法检测细胞向神经元和星形胶质细胞分化的水平

细胞在不同培养条件生长7 d后，取出各组玻片置于4%多聚甲醛液中固定30 min，之后对水凝胶上的细胞进行免疫荧光检测。先后加入NeuN、GFAP一抗和荧光标记的二抗，并用DAPI进行细胞核染色，比较各组细胞的神经元阳性表达情况。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 tsUC的鉴定结果

向UC感染携带tsSV40LT的逆转录病毒，以建立tsUC。免疫印迹结果显示，UC无SV40LT蛋白的表达，而tsUC可表达SV40LT蛋白(图1)，提示tsSV40LT病毒感染成功。

2.2 各组细胞的凋亡水平

相差显微镜下显示，各组均有悬浮细胞，提示细胞死亡，tsUC+提取液组贴壁细胞多于其余两组。24 h PI染色结果显示，与UC组相比，其余三组均有PI表达阳性细胞，提示细胞凋亡(图2，见彩图页Ⅱ)。tsUC+提取液组细胞的凋亡比例高于UC+提取液组(P<0.05)，差异具有统计学意义；而UC组的细胞凋亡比例与tsUC组相比，差异无统计学意义( 表1)。

Fig. 1 Identification results of tsUC SV40LT: Simian 40 Large T-antigen; UC: Umbilical cord mesenchymal stem cells; tsUC: Temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells

2.3 各组细胞的增殖水平

采用BrdU标记细胞，3 d后行BrdU免疫荧光染色。结果显示，与UC组相比，UC+提取液组的BrdU阳性率显著增加(P<0.01)；与UC+提取组相比，tsUC+提取液组的BrdU阳性率却显著降低(P<0.01, 表1)。

GroupApoptosisrateBrdU⁃positiverateUC3．8±0．446．0±5．98tsUC4．0±0．658．3±4．67UC+extraction72．3±8．9849．0±5．98∗∗tsUC+extraction20．6±4．31##97．5±10．98##

UC：Human umbilical cord mesenchymal stem cells；tsUC：Temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells

**P<0.01vsUC group;##P<0.01vsUC+ extraction group

2.4 光镜下各组细胞的形态变化

相差显微镜下结果显示，UC组和tsUC组细胞在贴壁后形状各异，胞体摊开面积较大，镜下观察近乎透明，而且在观察的7 d内形态未发生明显变化；而tsUC+MHT组细胞贴壁后胞体的摊开面积明显较小，呈圆形或椭圆型，并出现长而纤细的突起(图3，见彩图页Ⅱ)。

2.5 各组细胞向神经细胞分化的水平

采用GFAP和NeuN免疫荧光染色分别标记星形胶质细胞和神经元。GFAP染色结果显示，与UC组相比，UC+提取组的GFAP阳性率显著减少(P<0.01)；与UC+提取组相比，tsUC+提取组的BrdU阳性率显著增加(P<0.01，图4，表1)。NeuN染色结果显示，与UC组相比，UC+提取组的NeuN阳性率显著减少(P<0.01)；与UC+提取组相比，tsUC+提取组的NeuN阳性率显著增加(P<0.01，图4，表2，图4见彩图页Ⅱ)。

3 讨论

Tab. 2 Cell differentiation rate of astrocytes and neurons in every group (%)

GroupAstrocytesNeuronUC22．34±2．698．99±1．05tsUC25．45±0．659．11±0．96UC+extraction6．84±0．88∗∗3．58±0．41∗∗tsUC+extraction19．58±2．06##8．10±0．98##

UC：Human umbilical cord mesenchymal stem cells；tsUC：Temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells

**P<0.01vsUC group;##P<0.01vstsUC+extraction group

微环境是指干细胞所处的基质中，对干细胞的命运(增殖/分化)起调控作用的三维空间和各种信号分子(生长因子及其受体、激素及介导分子)的总称。TBI后脑组织缺血缺氧、大量炎性介质的释放、兴奋性氨基酸的释放、与脂质过氧化反应有关的自由基损伤、钙离子的内流等，这些毒性物质均会加重损伤部位神经细胞的死亡或是不利于移植干细胞的存活。大量的基础研究和临床试验表明，干细胞移植治疗TBI 的效果不够理想，其原因主要与干细胞的低存活率相关。移植干细胞在目标部位存活是干细胞发挥作用的前提，而影响干细胞行为的决定性因素主要是局部的微环境。有研究表明，移植后1 周，90%的干细胞出现死亡。移植干细胞的大量死亡主要跟TBI 损伤局部缺血、缺氧、炎症、水肿的微环境有关。

脐带间充质干细胞在特定情况下具有多向分化的潜能[7]，在原位移植治疗TBI方面具有可观前景[8]。但由于TBI所致微环境的改变对细胞生长和增殖影响极大，因此限制了其在临床上的应用。众所周知，UC在37℃，5%CO2条件状态下生长状态最佳。在UC的基础上，通过转染携带温度tsSV40LT基因的病毒，成功建立了tsUC系。tsSV40LT 是SV40LT 的突变等位基因。SV40LT 可通过调控死亡阶段1(M1)和死亡阶段2(M2)而使细胞获得永生。33℃环境tsUC增殖活性最大，为最理想的生长条件，且培养3 d可达到70%～80%的融合度，而在37℃却明显减弱或消失。在前期研究中也已证实tsUC细胞系因表达tsSV40LT 蛋白在33℃下可以获得永生，但在37℃～39℃停止增殖而转向分化[8]。tsUC既能扩增干细胞数量以满足临床的需要，又能在正常脑温下条件性控制干细胞增殖以避免成瘤性，可解决目前干细胞移植面临的细胞数量少和致瘤潜能等关键问题，具有广阔的应用前景。

UC在类似于脑组织弹性模量(0.1～1.0 kPa)的基质中具有分化为神经元的能力[9]。因此本实验制备弹性模量为0.5 kPa的聚丙烯酰胺水凝胶，用以模拟脑组织的生物力学环境。同时提取TBI后大鼠的脑组织提取液，按一定比例加入细胞的培养基中，用以模拟脑组织损伤后的化学微环境。这些对于观察细胞的生长、分化情况都具有重要的意义，可从体外实验角度探讨在TBI后脑组织微环境作用下，亚低温对tsUC生长和分化的影响。

过去20年里，国内外许多实验室已经对亚低温进行了深入的研究，证实亚低温能对脑损伤或脊髓损伤的动物模型具有神经保护作用，并能改善其功能及预后。早在20世纪50年代，国外就已经有人将亚低温技术应用于心脏外科手术，取得显著效果。因此脑卒中、脑损伤以及脊髓损伤等神经科领域也逐渐开展低温治疗技术。亚低温在TBI治疗方面的机制有许多，主要包括降低脑代谢、抑制免疫或炎症反应、降低自由基等有害物质的堆积，通过改善血脑屏障和血管通透性而达到减轻脑水肿和降低颅内压的目的[10]。由此可见，亚低温能改善TBI后脑组织的物理和化学性质，维持脑细胞所处力学微环境和化学微环境的稳态。

根据国内外研究和本室前期实验结果，温敏干细胞的增殖活性在33℃环境里最大，在37℃里明显减弱或消失。同时，据本科临床治疗经验，亚低温控制的最佳温度为33℃左右。因此，临床3～5 d的亚低温治疗可为温敏干细胞提供最佳的温度，以促进移植干细胞的存活和增殖。

本实验结果显示，在模拟脑组织TBI的微环境中，UC组和tsUC组的细胞存活能力明显降低，而且几乎无向神经元分化的能力。而在亚低温的干预作用下，tsUC的生长和分化能力均有了极大的改善，提示亚低温可以提高tsUC对损伤环境的适应性，同时也说明联合亚低温干预的tsUC能更好地适应脑组织损伤环境，并保持向神经细胞分化的能力，为亚低温联合温敏干细胞移植治疗TBI的研究提供依据。

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Effect of chemical microenvironment after traumatic brain injury on temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells

ZHAO Ming-liang1,2, CHEN Yi-sheng2, LI Xiao-hong2, WANG Jing-jing2, TU Yue2, SUN Hong-tao2, ZHANG Sai2, CHEN Chong2△

(1. Center of Nerve Bio-medicine Therapy, the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People's Armed Police Forces,2. Institute of Brain Trauma and Neurological Disease, Neurotrauma Repair Key Laboratory of Tianjin, Tianjin 300162; 3. Graduate department of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China)

Objective: To simulate the chemical microenvironment of injured brain tissue, and to explore the effect of this chemical microenvironment on temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells (tsUC). Methods: Rat models of traumatic brain injury (TBI) were made by fluid percussion injury, and then the brain tissue extracts of the injured regions were acquired. Human umbilical cord mesenchymal stem cells (UC) were isolated and cultured, and the tsUC were obtained through the infection of temperature-sensitive Simian 40 Large T-antigen (ts-SV40LT) retrovirus. After that, both the two kinds of cells were cultured on the polyacrylamide gels which mimicking the elastic modulus of brain. Four groups were included: UC cultured under normal temperature (UC group), UC cultured added brain tissue extract under normal temperature (UC plus extract group), tsUC cultured under mild hypothermia (tsUC group), and tsUC added brain tissue extract under mild hypothermia for 3 days, then normal temperature for 4 days (tsUC plus extract group). After 24 hours, the apoptosis level was checked. Cell growth and morphological changes in each group were given dynamic observation. Seven days later, cell immunofluorescences were implemented for examining neural differentiation level. Results: Compared with UC plus extract group, the apoptosis and proliferation in UC plus extract group were significantly reduced (P<0.01)and increased (P<0.01)respectively. Cell immunofluorescence showed that the both GFAP and Neuron positive cells were significantly enhanced in UC plus extract group than those in tsUC plus extract group. Conclusion: tsUC combining with mild hypothermia could significantly reverse injury induced cell apoptosis, improve cell proliferation and neural differentiation under chemical microenvironment after brain injury, which confirmed the adaptation and resistance of tsUC under mild hypothermia after TBI.【KEY WORDS】 traumatic brain injury; chemical microenvironment; human umbilical cord mesenchymal stem cells; temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells; mild hypothermia; brain tissue extracts

国家自然科学基金项目(81471275，81341113， 81271392，81401067，81301050)

2015-02-04

2015-03-16

R3

A

1000-6834(2015)03-207-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.004

△【通讯作者】Tel： 022-60577174； E-mail： chongchen12@hotmail.com