孕酮对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用及其机制*

李新娟， 魏林郁， 李超， 李东亮

(新乡医学院生理学与神经生物学教研室， 河南 新乡 453003)



孕酮对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用及其机制*

(新乡医学院生理学与神经生物学教研室， 河南 新乡 453003)

目的：观察孕酮(PROG)对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后的神经保护作用，并探讨其作用机制。方法：120只雄性SD大鼠随机分为：假手术组、大脑中动脉栓塞(MCAO)组和PROG+MCAO组(n=40)。线栓法建立大鼠右侧MCAO模型，PROG+MCAO组于建模型前30 min按8 mg/kg腹腔内注射PROG。大鼠脑缺血2 h再灌注0、24、48、72 h，通过Longa评分标准进行神经功能缺陷评分；实时荧光定量聚合酶链反应技术检测大鼠脑组织中双孔道结构域钾离子通道3(TASK3)mRNA的表达。结果：PROG(8 mg/kg)可显著降低大鼠脑缺血2 h再灌注24、48、72 h时的神经功能缺陷评分(P<0.05)。与假手术组相比，MCAO组再灌注各时间点脑组织TASK3 mRNA的表达均显著降低(P<0.05)；与MCAO组相比，PROG + MCAO组再灌注各时间点大鼠脑组织中TASK3 mRNA的表达均显著增多(P<0.05)。结论：PROG可改善局灶性脑缺血/再灌注损伤后大鼠神经功能缺陷症状，其作用机制可能与上调脑组织中TASK3 mRNA的表达有关。

孕酮；脑缺血；再灌注损伤；TASK3

缺血性脑血管疾病是导致老年人残疾最常见的一种疾病，且随着人口老龄化，其发病率还有增加的趋势。因此进一步研究其发病机制和寻找有效的防治措施已成为神经科学研究的热点。

脑缺血时最初的病理生理改变为脑组织氧供给不足和内环境pH值的迅速下降，而酸敏感的双孔道结构域钾离子通道3(two-pore domain K channel 3，TASK3)的功能状态可随着pH值及氧含量的降低受到抑制，甚至变为关闭状态[1]，TASK3通道的关闭将导致神经元的去极化，引发神经元钾离子依赖性凋亡[1,2]。

越来越多的研究表明孕酮(progesterone，PROG)具有神经保护作用[3]，本课题组前期实验也证实PROG可对脑缺血大鼠发挥保护作用[4]。但PROG是否影响大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury)过程中TASK3 mRNA的表达目前未见报道，本研究以大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠为研究对象，观察PROG对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠脑组织中TASK3 mRNA表达的影响，探讨其对缺血/再灌注损伤神经保护作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

PROG购于Sigma公司；RNAiso Plus试剂盒、 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒、SYBRPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)试剂盒均购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 动物分组与给药方法

SPF级雄性SD大鼠(动物合格证号：SCXK豫2010-0002)，体重(200±20)g，随机分为假手术组(Sham)、MCAO组和PROG + MCAO组(n=40)，各组按脑缺血/再灌注后不同时间随机分为再灌注0、24、48、72 h四个亚组(n=10)，PROG+MCAO组于建模型前30 min按8 mg/kg腹腔内注射PROG芝麻油液，假手术组和MCAO组于相同时间注射等容积芝麻油。

1.3 大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型的制备

参考Zea-Longa方法制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型[5，6]。大脑中动脉栓塞2 h时，固定大鼠，缓慢将栓线拔出10 mm实现血液再灌注，剪断线栓外露部分。假手术组仅分离颈总动脉、暴露颈内外动脉分叉，造模后保温常规饲养。

1.4 大鼠神经功能缺陷评分

参照Longa 5分制评分标准对实验大鼠进行神经功能缺陷评分[7]：0分：无神经功能缺失症状；1分：轻度局灶性神经功能缺失(不能完全伸展对侧前肢)；2分：中度局灶性神经功能缺失(向对侧转圈)；3分：重度局灶性神经功能缺失(向对侧倾倒)；4分：不能自发行走，意识水平降低。评分为0分或4分的大鼠均为造模失败大鼠，予以剔除，并随机补齐每亚组10只大鼠。

1.5 引物的设计

根据大鼠基因全序列设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，大鼠GAPDH和TASK3的引物序列及片段长度见表1。

1.6 脑组织中RNA的提取

大鼠深度麻醉后处死，迅速断头取脑，将100 g脑组织置于玻璃匀浆器中，加入1 ml TRIzol液，在冰浴中将组织研碎，颠倒混匀后，静置5 min，严格按试剂盒说明书逐步进行RNA抽提，以260 nm及280 nm吸光度值计算所获RNA含量及纯度，分装后 - 80℃保存。

Tab. 1 Primer sequences for Real-time PCR(bp)

1.7 cDNA的制备

等量取上述每个标本总RNA 1 μg，首先去除基因组DNA；取DEPC水处理过的EP管，依次加入gDNA Eraser Buffer(5 ×)2 μl、gDNA Eraser 1 μl、上述各标本总RNA 1 μl(1 μg)，最后加RNase free dH2O 至10 μl；反应条件：42℃ 5 min，4℃备用。然后进行反转录反应：取DEPC水处理过的EP管，依次加入RNase free dH2O 1 μl、 PrimeScript Buffer 2(for real time，×5)4 μl、RT Primer Mix 4 μl、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl混匀后加入至上述10 μl反应体系的EP管中，反应条件37℃ 15 min，85℃ 5 s，即逆转录成cDNA，-20℃保存。

1.8 Real-time PCR检测大鼠脑组织TASK3 mRNA表达及结果分析

总反应体积20 μl，取DEPC水处理过的EP管，依次加入SYBRPremix Ex TaqTMII(×2)10 μl、TASK3或GAPDH Forward Primer(0.4 μmol/L)0.8 μl、TASK3或GAPDH Reverse Primer(0.4 μmol/L)0.8 μl、cDNA 1 μl(50 ng)，最后加dH2O 至20 μl。在ABI Stepone Plus Real-time PCR仪上进行PCR反应，扩增条件：预变性95℃ 30 s；PCR反应95℃ 3 s，60℃ 30 s，45个循环。

分别测定每个样品TASK3 mRNA和GAPDH mRNA的Ct值，每个样品均做复孔以减少操作误差。根据扩增曲线确定Ct值(cycle threshold)，利用2-△△Ct法计算TASK3 mRNA的相对表达量。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 PROG对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠神经功能缺陷评分的影响

局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠在再灌注24 h时神经功能缺陷评分最高，而后逐渐降低。与MCAO组再灌注24 h(2.67±0.49)、48 h(2.25±0.57)、72 h(1.86±0.41)相比，PROG+MCAO组再灌注24 h(2.01±0.74)、48 h(1.77±0.42)、72 h(1.34±0.39)可明显降低大鼠神经功能缺陷评分(P<0.05,图1)。

2.2 MCAO组大鼠脑缺血2 h再灌注后不同时间点脑组织TASK3 mRNA表达的变化

Real-time PCR结果显示：MCAO组再灌注各时间点GAPDH mRNA扩增曲线无明显漂移现象，而对应的TASK3 mRNA扩增曲线出现明显的漂移(图2)；通过计算各亚组2-△△Ct值并经统计分析发现MCAO组中再灌注0 h大鼠脑组织中TASK3 mRNA表达最高，与再灌注0 h相比较，再灌注24、48、72 h大鼠脑组织TASK3 mRNA表达显著降低(P<0.05，P<0.01)，且再灌注48 h大鼠脑组织TASK3 mRNA表达最低(P<0.01)，再灌注72 h大鼠脑组织TASK3 mRNA表达稍有升高(P<0.01，表1)。

Fig. 2 Amplification curve of TASK3 and GAPDH in different time points rats brain after focal cerebral ischemia/reperfusion of MCAO group TASK3: Two-pore domain K channel 3; MCAO: Middle cerebral artery occlusion; 1: 0 h; 2: 24 h; 3: 48 h; 4: 72 h

2.3 PROG对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠脑TASK3 mRNA表达的影响

Real-time PCR结果显示：各组再灌注各时间点GAPDH mRNA扩增曲线无明显漂移现象，而对应的TASK3 mRNA扩增曲线出现明显的漂移(图3)；通过计算各亚组2-△△Ct值并经统计分析发现与假手术组相比，MCAO组再灌注各时间点脑组织TASK3 mRNA的表达均显著降低(P<0.05)；与MCAO组相比，PROG+MCAO组再灌各时间点大鼠脑组织中TASK3 mRNA的表达均显著增多(P<0.05，P<0.01，表1)。

Group0h24h48h72h Sham⁃operated1．012±0．0061．013±0．0211．006±0．0141．017±0．019MCAO0．874±0．054#0．821±0．049∗#0．476±0．041∗∗#0．732±0．047∗∗#PROG+MCAO0．977±0．060△△0．867±0．048△0．791±0．038△△0．834±0．312△△

PROG: Progesterone; TASK3: Two-pore domain K channel 3; MCAO: Middle cerebral artery occlusion

*P<0.05，**P<0.01vsMCAO group reperfusion 0 h;#P<0.05vssham-operated group;△P<0.05，△△P<0.01vsMCAO group

3 讨论

双孔道结构域钾离子通道家族(two-pore domain potassium channel familly，K2P)是几乎没有时间或电压依赖性产生背景电流的钾离子通道，可通过调节膜静息电位从而调节神经细胞的兴奋性[2，8]。TASK3是K2P家族中有功能的pH敏感亚基之一，广泛分布于神经细胞[9]，TASK3通道在正常pH(pH 7.4)条件下主要表现为开放状态，只有在氢离子浓度较高的酸性环境中才转变为关闭状态[10]。脑缺血时局部血流的减少可引起脑组织氧供给不足及无氧酵解增强，后者产生的乳酸及ATP水解产生的质子可使脑组织pH值降至6.0～6.5[11]，而pH 值下降和低氧可快速使TASK3通道被抑制导致膜去极化[1]，进而引发神经元钾离子依赖性的凋亡[1，2]，由此可见TASK3通道在脑缺血损伤过程中扮演着重要的角色。

本研究通过建立短暂性大脑中动脉栓塞模型，发现脑缺血2 h，再灌注0、24、48、72 h大鼠脑组织中TASK3 mRNA表达均较假手术组显著降低，且通过Longa 5分制评分法对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠在上述时间点进行神经功能缺陷评分，发现局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠在再灌注后各时间点神经功能缺陷评分均显著高于假手术组，这些提示脑缺血/再灌注损伤后TASK3 mRNA的低表达可能与大鼠脑缺血/再灌注损伤后神经功能缺陷相关。

Fig. 3 Amplification curve of TASK3 and GAPDH at different time points rats brain after focal cerebral ischemia/reperfusion of each groups TASK3: Two-pore domain K channel 3; a: 0 h; b: 24 h; c: 48 h; d: 72 h; 1: Sham-operated group; 2: MCAO group; 3: PROG+MCAO; MCAO: Middle cerebral artery occlucsion; PROG: Progesterone

作为神经保护甾体的PROG具有良好的抗脑缺血损伤引发的神经细胞凋亡的能力[3]。本实验观察了PROG(8 mg/kg)对大鼠脑缺血2 h，再灌注0、24、48、72 h神经功能缺陷评分和脑组织中TASK3 mRNA表达的影响，结果发现，PROG可显著降低大鼠脑缺血2 h，再灌注24、48、72 h的神经功能缺陷评分，提示PROG对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠神经功能的恢复有促进作用；并且还发现PROG + MCAO组脑缺血/再灌注各时间点大鼠脑组织中TASK3 mRNA的表达显著高于MCAO组，这些提示PROG可能通过上调脑缺血/再灌注损伤大鼠脑组织中TASK3 mRNA的表达，减少TASK3介导的钾离子依赖性的凋亡，从而改善脑缺血/再灌注损伤后的神经功能缺陷症状，这可能是PROG对脑缺血/再灌注损伤大鼠发挥神经保护作用的机制之一，而这种保护机制是否还通过调节脑缺血/再灌注损伤后脑组织中TASK3通道的开放而起作用？这值得进一步研究。

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Neuroprotective effect of progesterone on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats and its mechanism

LI Xin-juan, WEI Lin-yu, LI Chao-kun△, LI Dong-liang

(Department of Physiology and Neurobiology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)

Objective: To observe the neurological protective effects of progesterone ( PROG ) on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats and to explore its possible mechanism. Methods: One handred and twenty male SD rats were divided into three groups randomly: sham-operated group, middle cerebral artery occlusion ( MCAO ) group and PROG + MCAO group(n=40). The right temporary MCAO model was established by the line-embolism method. The PROG + MCAO group rats were according to 8 mg/kg intraperitoneal injection PROG , after that 30 min, the rats were suffered ischemia/reperfusion. After rats were suffered ischemia for 2 h and reperfusion 0, 24, 48, 72 h stress, the nervous functional defect degree were evaluated by longe scoring, and the expression of two-pore domain K channel 3 (TASK3) mRNA in brain tissue were detected by the real-time PCR. Results: PROG ( 8 mg/kg ) could significantly reduced the nervous functional defect degree in rats after ischemia/reperfusion 24, 48, 72 h (P<0.05). The results of real-time PCR showed that the TASK3 mRNA expression in the brain tissue at all time points significantly decreased in MCAO group compared with sham-operated group (P<0.05). However, compared with MCAO group, the expression of TASK3 mRNA in brain tissue at all time points dramatically increased in PROG + MCAO group (P<0.05). Conclusion: PROG can improve the nervous functional defect degree after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats, and the mechanism might be associated with up-regulating the expression of TASK3 mRNA in brain tissue.

progesterone; cerebral ischemia； ischemia/reperfusion injury; TASK3

国家自然科学基金资助项目(81100912，81271376)

2014-12-29

2015-02-28

R329.26；R743

A

1000-6834(2015)03-231-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.010

△【通讯作者】Tel: 0373-3029104； E-mail： lichaokun@hotmail.com