清髓性不含抗胸腺细胞球蛋白方案的非血缘脐血移植后免疫重建与巨细胞病毒感染情况分析

李桂芳，汪丽钰，孙光宇，汤宝林，朱小玉，童 娟，郑昌成，姚 雯，张 磊，薛 磊，皖 湘，宋闿迪，强 萍，张旭晗，刘会兰，孙自敏

清髓性不含抗胸腺细胞球蛋白方案的非血缘脐血移植后免疫重建与巨细胞病毒感染情况分析

李桂芳，汪丽钰，孙光宇，汤宝林，朱小玉，童 娟，郑昌成，姚 雯，张 磊，薛 磊，皖 湘，宋闿迪，强 萍，张旭晗，刘会兰，孙自敏

目的探讨清髓性不含抗胸腺细胞球蛋白（ATG）方案的非血缘脐血移植（UCBT）后巨细胞病毒（CMV）感染（血症）的发病情况。方法回顾性分析100例接受清髓性不含ATG方案的UCBT患者移植后CMV血症及CMV病发生情况，同时初步分析UCBT后受者早期淋巴细胞重建情况。结果UCBT后受者外周血CMV拷贝数＞10／ml发生率为92.7%，血CMV拷贝数＞103／m l发生率为75.3%；中位发生时间为42 d。CMV病发生率为1.03%。CMV转阴的中位时间为94 d。UCBT后淋巴细胞持续稳定上升，中位CD3＋CD8＋T细胞及CD3＋CD4＋T细胞分别于移植后2个月及5个月达正常范围。结论清髓性不含ATG方案的UCBT后T细胞免疫重建相对较快，CMV血症发生率高，但CMV病发生率较低。

巨细胞病毒感染；脐血移植；预处理方案；免疫重建

异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）已成为治疗恶性血液病、某些遗传性疾病及先天性免疫缺陷病的有效方法。allo-HSCT后受者均存在免疫缺陷期，因受者淋巴细胞及其亚群的恢复在抵御移植后感染特别是病毒和真菌感染方面起决定性作用，因此巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染是移植后最常见的并发症之一［1］，其易感因素主要有：接受CMV血清阳性供者的造血干细胞的CMV血清阴性受者；接受环孢素、激素等免疫抑制剂治疗的患者；接受二次移植的患者［2］。CMV感染可导致CMV间质性肺炎、CMV性肠炎、CMV性肝炎等CMV病，若不及时治疗，死亡率可达90%以上［3］，其感染率和发病率的高低是评价移植预处理方案优劣的良好指标。

由于脐血具有移植后严重的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）发生率低和移植物抗白血病作用强的优势，非血缘脐血越来越多地用作无同胞人类白细胞抗原相合供体的患者进行allo-HSCT的移植物供源。脐血移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）后免疫重建（immune reconstitution，IR）特别是T细胞及其亚群重建明显延缓，所以早期感染相对死亡率增加。对该研究采用不含抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）清髓性方案的UCBT治疗恶性血液病100例，探讨该方案UCBT后受者CMV的感染和发病情况，并分析UCBT后受者淋巴细胞、T细胞和NK细胞等免疫细胞的早期重建情况，初步分析UCBT后早期IR与CMV感染及CMV病发生的可能内在联系。

1 材料与方法

1.1 病例资料回顾性分析2012年1月～2014年6月在安徽医科大学附属省立医院血液科行UCBT的100例患者的临床资料，其中男58例，女42例；年龄1.5～51岁，中位年龄13岁；体重12～90 kg，中位体重45 kg。患者原发病为慢性粒细胞白血病5例，急性淋巴细胞白血病57例，急性髓细胞白血病31例，急性混合细胞白血病1例，骨髓增生异常综合征4例，恶性淋巴瘤2例。进行移植的供受者均在移植前进行CMV抗体（IgG及IgM）检测，移植前受者血清CMV-IgM均为阴性，CMV-IgG阳性90例，阴性10例；脐血供者血清CMV-IgG及IgM均为阴性。移植前供受者血CMV-DNA均为阴性。

1.2 方法

1.2.1 移植预处理方案 方案包括：①分次全身照射＋环磷酰胺＋阿糖胞苷＋重组粒细胞集落刺激因子，而不加用以免疫抑制为主的药物ATG，本研究有54例使用该方案；②考虑全身照射有影响生长发育等毒副作用，对于生长发育期儿童采用经典BUCY2方案联合阿糖胞苷或氟达拉滨的方案，加用氟达拉滨（22例）或阿糖胞苷（24例）进一步增强抗白血病作用，并增加对受者的免疫抑制而促进植入。

1.2.2 GVHD的预防 环孢素A＋霉酚酸酯方案预防GVHD，环孢素A移植前1 d始3 mg／（kg· d），持续24 h静脉滴注。发生急性GVHD，维持环孢素A有效浓度并加用甲基泼尼松龙0.5～2.0 mg／（kg·d）；对肝脏GVHD改环孢素A为他克莫司口服，根据GVHD的严重度调整免疫抑制剂的疗程和用量；对于激素难治性GVHD，及时加用巴利昔单抗－舒莱及脐带间充质干细胞等二线免疫抑制药治疗。

1.2.3 CMV感染预防与监测 所有患者于移植后第1天开始给予阿昔洛韦注射液总量10 mg／kg，每日分2次静注。移植后1个月改为阿昔洛韦口服直至3个月，造血重建后开始每周2次，移植后2～6个月每周1次行血清CMV-DNA检查，出现血清CMV-DNA拷贝数＞103／ml给予更昔洛韦或者膦甲酸钠静脉滴注，直至CMV-DNA转阴后剂量减半维持治疗1～2周。

1.2.4 CMV-DNA的检测 EDTA抗凝血4℃静置后吸取上层血清50μl，加等量DNA提取液吹打均匀，100℃保温10 min，12 000 r／min离心5 min，取上清液为病毒DNA样本。取DNA样本5μl，6 000 r／min离心1 min后置于定量PCR仪器的孔样品槽内，按对应顺序设置阴性质控品、阳性质控参考品梯度（104～108拷贝数／ml）以及未知标本，每批实验均设标准曲线，同时应满足标准曲线的回归系数r＞0.97和阴性参照无扩增曲线，否则实验无效。循环条件：93℃预变性2min；然后93℃5 s，55℃60 s，先做10个循环，最后按93℃30 s，55℃45 s，30个循环结束。试剂盒（YZB／国0257-2011）购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.2.5 UCBT后T、NK细胞检测方法 通过4色流式细胞术动态检测UCBT后1～6、9、12个月受者T及NK细胞重建动力学变化，对移植后不同时间点受者外周血单个核细胞表面标记进行检测，荧光单克隆抗体标记淋巴细胞亚型包括T淋巴细胞（CD3＋、CD4＋、CD8＋）和NK细胞（CD3－CD16＋CD56＋）。用FACSCalibur流式细胞分析仪检测，然后用CellQuest software（BD Biosciences）分析。用淋巴细胞射门，确定下列细胞亚型：CD3－CD16＋CD56＋（NK细胞）、CD3＋（总T细胞）、CD3＋CD4＋（辅助T细胞）、CD3＋CD8＋（细胞毒T细胞）亚型。每个亚型根据光散射和前侧向散射的特征及以上单克隆抗体识别的表面抗原的表达来分析。

1.2.6 UCBT后CMV血症和CMV病的诊断 根据临床表现可将CMV感染分为CMV血症和CMV病，诊断标准参考Xuan et al［4］研究，CMV血症：有CMV病原学证据［CMV-DNA检测阳性和（或）CMV血清学显示CMV-IgG、IgM均阳性］但无CMV感染症状；CMV病：不明原因发热，伴或不伴白细胞总数下降50%，有CMV病原学证据及病毒损害脏器的组织病理学证据，如出现间质性肺炎、胃肠炎、肝炎、视网膜炎等器官、组织损害，需免疫组织化学证实或者组织活检病理证实并排除其他病因。本研究中定义血CMV-DNA阳性，无论拷贝数多少，即为CMV感染发生。

2 结果

2.1 UCBT后造血重建及淋巴细胞、单核细胞的恢复情况UCBT后中位随访时间为18.5个月（4～33个月），其中随访12个月以上者46例。100例患者中，未植入3例，存活78例，中性粒细胞植入时间11～38 d，中位时间为19 d，血小板植入时间为16～192 d，中位时间为37 d。移植后1个月受者单核细胞绝对数（absolute monocyte count，AMC）及淋巴细胞绝对数（absolute lymphocyte count，ALC）开始快速持续升高，中位AMC于UCBT后1个月达正常范围，AMC于UCBT后4～18个月均维持在较高水平；中位ALC于UCBT后2个月达正常范围，以后稳定持续升高，见图1。

2.2 UCBT后NK细胞和T细胞亚群的重建淋巴细胞中最快速重建的是NK细胞，其中位绝对数于UCBT后1个月达正常范围。T淋巴细胞亚群在UCBT后也一直呈上升趋势，CD3＋CD8＋T细胞上升最快，UCBT后2个月达正常范围，4～12个月高于正常值上限，以后轻度回落到正常值范围。CD3＋T细胞于UCBT后3个月达正常范围，6～12个月略高于正常值上限。CD3＋CD4＋T细胞于UCBT后5个月达正常范围，见图2。

2.3 CMV血症及CM V病发生率对97例获得造血重建的患者进行回顾性分析显示：90例（92.8%）发生CMV血症（血清CMV-DNA拷贝数＞10／ml），其中UCBT后第1个月内CMV-DNA拷贝数＞10／ml者有39例（40.2%），CMV-DNA拷贝数＞103／ml者有8例（8.2%）；最早发生CMV血症的时间为回输后17 d，移植后60 d内CMV-DNA拷贝数＞10／ml者有73例（75.3%），CMV-DNA拷贝数＞103／ml者有49例（50.5%）；移植后90 d内CMV-DNA拷贝数＞10／ml者有50例（51.5%），CMV-DNA拷贝数＞103／ml者有12例（12.4%）；移植后120 d内CMV-DNA拷贝数＞10／m l者有23例（23.7%），CMV-DNA拷贝数＞103／m l者有4例（4.1%）。回输脐血干细胞后3个月内CMV未感染者8例（8.2%），有1例明确诊断为CMV脑炎，脑脊液CMV-DNA阳性，抗病毒治疗后有效，其他UCBT后发生肝损害、肠炎及肺炎等病例均未能明确诊断与CMV感染有关。

患者外周血CMV-DNA拷贝数＞10／ml的时间为17～109 d，中位时间为32 d，发生率为92.8%；患者外周血CMV-DNA拷贝数＞103／m l的时间为19～181 d，中位时间为42 d，发生率为75.3%；经过抗病毒治疗后，患者外周血CMV转阴的时间为34～226 d，中位时间为94 d，其中CMV转阴时间超过120 d的患者均因发生GVHD而处于免疫抑制治疗中。患者CMV累积再激活率曲线显示，自移植后20 d开始出现感染，并呈逐渐上升趋势，到移植后40～80 d曲线上升速度最快，之后逐渐变慢，120 d之后曲线将近平缓，见图3。为分析移植后CD3＋CD8＋细胞毒T细胞的重建速度与血CMV感染发生率的关系，考虑到CMV感染发生的中位时间在移植后42 d，故分析移植后1个月外周血CD3＋CD8＋细胞毒T细胞数与CMV感染发生的关系显示：移植后1个月CD3＋CD8＋T细胞的中位数作为界点（中位CD3＋CD8＋T细胞数为172／μl），将细胞数高于172／μl的患者与低于172／μl的患者CMV感染发生率进行比较，两者差异无统计学意义（P＝0.98）。

3 讨论

CMV感染及CMV病是造血干细胞移植患者术后最常见的机会性感染和最严重的移植并发症之一；据报道［5］，在移植后的第1年里，超过50%的受者会有CMV原发感染或再激活的实验室证据。本研究针对不含ATG的清髓性预处理的UCBT后患者的资料分析，显示移植后患者CMV感染发生率高达92.8%（移植前血CMV-DNA阴性，移植后血CMV-DNA阳性），血CMV-DNA＞103拷贝数／ml发生率也高达75.3%，与研究［6］相似。研究［7］显示，CMV感染在儿童中的发生率为91.7%，而CMV病发生率为19%，CMV病发生率明显高于本研究。UCBT后高发生的CMV感染的可能原因主要有：①UCBT供者CMV血清学抗体均为阴性，而受者几乎均为CMV血清学阳性；②输注的UCBT中所含T淋巴细胞少且表型为初始（naïve）型，移植物中缺少抗CMV特异性细胞毒T细胞（cytotoxic lymphayte，CTL）；③包含ATG的预处理方案进一步延缓了UCBT后IR。另外，清髓性预处理也可能延缓早期IR，增加CMV及EB病毒等感染率［4］。

研究［1，8－9］报道移植前供受者血清学状态是移植后发生CMV感染的主要危险因素，供者CMV-IgG阴性，受者CMV-IgG阳性者CMV再激活率最高，死亡率也最高。最近研究［10］证实在清髓性预处理方案的非血缘allo-HSCT后，CMV血清学阳性受者接受CMV血清学阳性供者（与CMV阴性供者相比较）移植物可改进总生存率，而CMV血清学阴性受者接受CMV血清学阳性供者移植物可降低生存率。本研究由于脐血供体CMV血清学均为阴性，而移植受者血清学阳性率高达90%，所以UCBT后受者CMV再激活可能是CMV感染的一个主要原因。

移植物中所含有的CMV特异性CTL以及移植后由CMV抗原刺激和细胞因子驱动的naïve T细胞转变成的CMV特异性CTL是清髓性allo-HSCT后控制CMV感染的主要免疫细胞。采用人类白细胞抗原相合同胞供体移植时，当患者和供者allo-HSCT前CMV抗体均阳性，CMV-CTL的恢复快速，可达到所有CD8＋T细胞的21%；若供受者CMV抗体均为阴性，则CMV特异性CTL早期重建发生时间延迟。接受非血缘移植的患者与同胞移植患者比较，CMVCTL恢复推迟，allo-HSCT后100 d内没有发现CMV-CTL产生［11－12］，由此可以推测UCBT后CMV发生率高可能与CMV-CTL重建延迟有关。研究［13］显示尽管UCBT物中基本不含有CMV特异性CTL，但在UCBT后8周受者外周血中就能检测到CMV特异性CTL，考虑为脐血naïve T细胞在抗原刺激和细胞因子驱动下可转变成CMV特异性CTL。然而这些CMV特异性CTL细胞的数量很有限、功能仍不完善，不能完全清除CMV血症，受者只有在CD4＋CD45RA＋T细胞恢复后才能完全清除CMV血症，这可能是由于本研究采用了含ATG的预处理方案，由于ATG较长的半衰期，抑制了移植后naïve T细胞的外周扩增，进一步延缓了UCBT后T细胞重建。因为含ATG的方案的UCBT受者移植后T细胞包括CMV特异性CTL重建延缓，故含ATG方案的UCBT后CMV病发病率相对增高［13－14］。

本研究显示CMV病发生率相对偏低，考虑与本中心采用了不含ATG的预处理方案有关，该方案UCBT后总淋巴细胞、单核细胞及NK细胞重建速度均较快，中位NK细胞绝对数于移植后1个月内即可达正常水平。本研究分析移植后1个月CD3＋CD8＋T细胞数与CMV感染发生的关系表明，UCBT后1个月CD3＋CD8＋T细胞数与CMV感染率差异无统计学意义，但未检测CMV特异性CTL，可能是因为总CD3＋CD8＋T细胞数的重建不能完全反应CMV特异性CTL的重建。本研究组前期研究［15］显示UCBT 4个月后受者外周血终末分化效应记忆T细胞比例明显升高，也提示UCBT后T细胞在发挥着抗感染等效应功能。另外UCBT后密切监测CMV再激活，及时干预治疗也是降低CMV病的一个主要因素。由于本研究对UCBT后发生肺炎、肠炎、肝炎等的病例未行脱落细胞及组织学相关CMV抗原检测，也可能导致统计的CMV病发生率偏低。

由于UCBT独特的特征（CMV血清学阴性、naïve T细胞），UCBT后CMV感染及CMV病的发生高是影响UCBT成功的关键因素之一。在目前临床上尚不能进行CMV特异性T细胞输注的情况下，通过改进移植方案来加快UCBT后IR特别是CMV特异性T细胞的恢复是降低CMV病的一个重要措施，而采用不含ATG的方案是加快UCBT后IR的主要方法。本研究采用不含ATG的方案加快了UCBT后IR，UCBT后半年内密切监测CMV-DNA、及时进行干预治疗，也是降低UCBT患者CMV发生率的重要措施。

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Analysis of immune reconstitution and the incidence of cytomegalovirus infection after unrelated cord blood transp lantation follow ing m yeloablative conditioning w ithout antithym ocyte globulin

Li Guifang，Wang Liyu，Sun Guangyu，et al
（Dept of Hematology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To investigate the incidence of cytomegalovirus infection after unrelated cord blood transplantation（UCBT）following myeloablative conditioning without antithymocyte globulin（ATG）.MethodsThe data of100 patients，who underwent UCBT，were collected，and the incidences of CMV infection and CMV disease，as well as primary lymphocytes reconstitution were analyzed retrospectly.ResultsThe incidence of plasma CMV-DNA copies＞10／ml and＞103／ml in peripheral blood（PB）of patients after UCBT were 92.7%and 75.3%，respectively.Themedian time of plasma CMV-DNA copies＞103／m l in PB of patients after UCBTwas42 days.The incidence of CMV disease was1.03%.Themedian time for CMV clearance was 94 days.Lymphocytes counts steadily increased after UCBT and themedian count of CD3＋CD8＋T cells and CD3＋CD4＋T cells reached the normal level atmonth 2 and 5 after UCBT respectively.ConclusionThe immune reconstitution of T cell subset is relatively fastafter UCBT followingmyeloablative conditioning without ATG and the incidence of CMV viremia is high，but the incidence of CMV disease is low after this UCBT protocal.

cytomegalovirus infection；unrelated cord blood transplantation；conditioning regimen；immune reconstitution

R 512.93

A

1000－1492（2015）08－1128－05

2015－03－16接收

安徽省科技厅年度科研项目（编号：1301043028）；安徽省卫生厅医学科研课题（编号：13zc018）

安徽医科大学附属省立医院血液科，合肥 230001

李桂芳，女，硕士研究生；

刘会兰，女，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：liuhuilan＠medmail.com.cn