1873例结核感染T细胞斑点试验检测阳性患者的临床分析

张娟 孙娇 李莹 王悦 孙秀华 马静红 邢黎莉 谭珂 彭娇 孙炳奇



·论著·

1873例结核感染T细胞斑点试验检测阳性患者的临床分析

张娟 孙娇 李莹 王悦 孙秀华 马静红 邢黎莉 谭珂 彭娇 孙炳奇

目的 探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测结果与结核病患者临床表现的相关性。方法 选取临床确诊结核病且T-SPOT.TB检测阳性患者1873例，并从患者的基本情况、细菌学、影像学及常规检查等4个方面对T-SPOT.TB检测结果[SFCs(个)/106PBMCs]与结核病患者临床表现的相关性进行比较分析。结果 初治患者外周血单核细胞(PBMCs)中斑点形成细胞 (SFCs)数 [A孔中位数17个，B孔中位数13个]明显高于复治患者[A孔中位数9个，B孔中位数9个] (A孔U=364 391.5，P<0.01；B孔U=364 259.0，P<0.01)；中青年患者SFCs数[A孔中位数17个，B孔中位数12个]明显高于老年患者[A孔中位数9个，B孔中位数9个](A孔U=304 368.5，P<0.01；B孔U=302 802.0，P<0.01)；菌阳患者的SFCs数[A孔中位数27个，B孔中位数20个]明显高于菌阴患者[A孔中位数10个，B孔中位数10个](A孔U=298 504.0，P<0.01；B孔U=279 815.5，P<0.01)；肺部有空洞的患者SFCs数[A孔中位数32个，B孔中位数25个]明显高于肺部无空洞的患者[A孔中位数10个，B孔中位数9个](A孔U=208 015.5，P<0.01；B孔U=216 424.5，P<0.01)；外周血单核细胞升高的患者SFCs数[A孔中位数21个，B孔中位数20个]明显高于外周血单核细胞正常的患者[A孔中位数10个，B孔中位数9个](A孔U=308 522.0，P<0.01；B孔U=307 748.0，P<0.01)。结论 T-SPOT.TB的SFCs计数虽然并不能完全与结核病活动程度呈正相关，但仍然存在着结核病活动程度越高SFCs数越多的趋势。

潜伏性结核/诊断； 酶联免疫斑点测定

结核病是危害人类生命健康的主要疾病之一，是当今世界单一致病菌引起死亡率最高的疾病，占世界总死亡率的第七位。直到今天，全球结核病仍呈持续蔓延之势[1]。因此，快速准确地诊断结核病及有效控制结核病的蔓延成为至关重要的问题。近年来γ-干扰素释放试验 (interferon gamma release assay，IGRA)方法之一的结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测技术，因其高特异度和高敏感度越来越广泛地应用于结核病[尤其是潜伏性结核感染(LTBI)]的临床诊断，但是却很少有报告探讨T-SPOT.TB 检测外周血单个核细胞(PBMCs)中斑点形成细胞 (SFCs)数[SFCs(个)/106PBMCs]与临床症状的相关性。本研究对结核病患者T-SPOT.TB 检测结果与临床症状的相关性进行探讨，希望此项检测结果能够为临床诊治提供更多的参考依据。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析本院2013年8月至2014年8月临床确诊为结核病、且T-SPOT.TB检测阳性的患者1873例，平均年龄(49.67±18.72)岁；其中男1156例，平均年龄(50.60±18.18)岁；女717例，平均年龄(48.18±19.49)岁。所有患者均排除糖尿病、艾滋病等免疫系统缺陷性疾病。

二、分组方法

肺结核并发症、初治和复治、肺结核和肺外结核、菌阴和菌阳结核病患者分组标准均参照《肺结核诊断和治疗指南》[2]。本研究涉及的单核细胞正常值为(0.1～0.6)×109/L，淋巴细胞正常值为(1.1～3.2)×109/L。

三、T-SPOT.TB试验

应用上海复星医药科技有限公司提供的结核感染T细胞斑点诊断试剂盒，按试剂盒说明书进行检测判断结果。其中A孔和B孔为平行检测孔，A孔内包被早期分泌性靶抗原6 (early secretory antigenic target 6，ESAT-6)，B孔内包被培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)抗原。结果判读：空白对照孔内SFCs<10个且阳性对照孔内SFCs>20个时视为实验有效。当ESAT-6或CFP-10任一检测孔达到以下标准则判定为阳性结果：①如果空白对照孔SFCs<5个，检测孔SFCs减去空白对照孔SFCs≥6个。②如果空白对照孔SFCs≥6个，检测孔SFCs必须>2倍的空白对照孔SFCs。

四、统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，偏态分布的计量资料以中位数和上下四分位数表示，组间两两比较采用Mann-WhitneyU检验，组内比较采用Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同人群外周血T-SPOT.TB检测结果

表1所示，在全体患者中，有1219例初治患者，654例复治患者，初治患者的A孔和B孔SFCs显著高于复治患者，且差异有统计学意义(A孔U=364 391.5，P<0.01；B孔U=364 259.0，P<0.01)，而男性和女性之间差异无统计学意义(A孔U=414 760.0，P>0.05；B孔U=416 904.5，P>0.05)。中青年(16～60岁)A孔和B孔SFCs显著高于老年(>60岁)组，差异具有统计学意义(A孔U=304 368.5，P<0.01；B孔U=302 802.0，P<0.01)。

二、肺结核组与肺外结核组外周血T-SPOT.TB检测结果

表2所示，在1873例患者中，有1498例肺结核患者，375例肺外结核患者，肺结核组与肺外结核组A孔和B孔SFCs差异无统计学意义(A孔U=279 633.0，P>0.05；B孔U=288 622.0，P>0.05)。

表1 不同患者外周血T-SPOT.TB检测结果

注 表1 中年龄分组未包括小儿患者，因为该组患者只有9例，样本数太少，故未单独进行数据统计

表2 肺结核组与肺外结核组外周血T-SPOT.TB检测结果

三、菌阴与菌阳结核病组外周血T-SPOT.TB检测结果

表3 所示，在1873例患者中，有1549例患者进行了细菌学检查，其中1067例菌阴患者，482例菌阳患者。菌阳患者A孔和B孔斑点中位数分别为27和20个，显著高于菌阴组的10和10个，差异有显著统计学意义(A孔U=298 504.0，P<0.01；B孔U=279 815.5，P<0.01)。

四、结核病患者有无并发症的外周血T-SPOT.TB检测结果

如表4所示，在1873例患者中，合并呼吸衰竭等并发症的患者为110例，但结核病患者有无并发症并未对T-SPOT.TB检测的SFCs造成明显影响，两组间差异无统计学意义((A孔U=104 122.0，P>0.05；B孔U=92 436.5，P>0.05)。

五、结核病影像学所见有无空洞和钙化患者的外周血T-SPOT.TB检测结果

表5所示，在1873例患者中，有323例患者肺部影像学显示有空洞，空洞组患者SFCs显著高于无空洞组，差异有显著统计学意义(A孔U=208 015.5，P<0.01；B孔U=216 424.5，P<0.01)。钙化组与无钙化组患者间比较，差异无统计学意义(A孔U=175 777.0，P>0.05；B孔U=192 415.0，P>0.05)；而钙化<3年组患者的SFCs明显多于钙化>3年组，其中A孔的结果两者差异无统计学意义(A孔U=3180.0，P>0.05)，B孔的结果两者差异有统计学意义(B孔U=28 805.0，P<0.05)。

六、血常规是否异常患者的外周血T-SPOT.TB检测结果

表6所示，1867例患者进行血常规检测，单核细胞绝对值升高的患者523例，单核细胞绝对值正常患者1341例，单核细胞绝对值降低患者仅3例，无法进行统计学分析。淋巴细胞绝对值升高者32例，淋巴细胞绝对值正常者1459例，淋巴细胞绝对值降低者376例。单核细胞升高组A孔和B孔SFCs均明显高于单核细胞正常组，差异有显著统计学意义(A孔U=308 522.0，P<0.01；B孔U=307 748.0，P<0.01)；而淋巴细胞异常组中仅有淋巴细胞降低组A孔与正常组相比差异有统计学意义(U=249 017.0，P<0.01)。

表3 菌阴与菌阳结核病组外周血T-SPOT.TB检测结果

表4 结核病患者有无并发症的外周血T-SPOT.TB检测结果

表5 结核病影像学所见有无空洞和钙化患者的外周血T-SPOT.TB检测结果

表6 血常规是否异常患者的外周血T-SPOT.TB检测结果

七、同组内A孔和B孔SFCs中位数比较

表7所示，对于同组内样本的A孔和B孔SFCs进行比较，采用Wilcoxon秩和检验，只有有钙化组患者的A孔和B孔间差异有统计学意义(Z=-2.141，P<0.05)，其他组内A孔和B孔SFCs差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

表7 同组内A孔和B孔SFCs中位数比较

讨 论

酶联免疫斑点试验(ELISPOT)技术是近年来发展起来的一种细胞因子检测技术[3]。目前研究认为T-SPOT.TB技术能够较敏感地诊断出LTBI[4-8]，然而T-SPOT.TB诊断结果与结核病患者临床表现之间是否具有一定的相关性[9]，目前尚无深入研究。本研究回顾性分析了1873例T-SPOT.TB阳性的结核病临床确诊患者，并从患者的基本情况、细菌学、影像学及常规检查4个方面分析了T-SPOT.TB检测结果与结核病患者临床表现之间的相关性。

本研究发现，初治患者SFCs显著高于复治患者 (P<0.01)，可能由于复治结核病患者的免疫功能受到抑制，T淋巴细胞免疫应答能力下降。且复治结核病患者随着病情进展，机体细胞免疫功能进一步下降，并逐步缺乏相应的免疫效应，细胞激活或免疫抑制进一步加重，减弱了T淋巴细胞亚群对结核分枝杆菌的杀灭作用。在对中青年组与老年组的比较发现，中青年组A孔和B孔SFCs均显著高于老年组 (P<0.01)，可能是与老年患者免疫功能低下，尤其是免疫屏障功能降低(T淋巴细胞增殖及活性降低)有关。由此表明，尽管以前的研究认为T-SPOT.TB检测结果受受试者免疫状态影响较小[10-11]，但在应用此项技术时，也应尽量考虑到受试者的免疫因素干扰[12]。

在分析的1873例患者中，其中有1549例患者进行细菌学检查，482例菌阳患者A孔和B孔SFCs数显著高于菌阴组(1067例)(P<0.01)，表明T-SPOT.TB检测的SFCs数高低与患者的荷菌量有一定关系，这与以往的一些报道是一致的[13-14]。Tsao等[15]发现高细菌负荷肺结核患者的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IFN-γ水平最高，因此认为IFN-γ是局部炎性部位的细菌负荷标志物。本研究结果显示，患者T-SPOT.TB 检测的SFCs随着痰菌数量增加而上升，这与其他学者的研究结果是一致的。国外文献报道，痰菌阳性程度与T-SPOT.TB检测的SFCs数高低有关[16]。有学者分别对结核感染患者在结核感染治疗的最初2周内、治疗结束时及治疗结束6个月后进行T-SPOT.TB及产生特异性抗原的外周血单核细胞数(即SFCs数)的检测，结果显示随着治疗的深入，T-SPOT.TB的阳性率降低，阳性患者的SFCs数呈下降趋势[17]。然而，也有一些研究认为，细菌负荷量与T-SPOT.TB检测结果呈负相关，即高菌负荷的肺结核患者的外周血T淋巴细胞在受到特异性结核抗原刺激后存在产生IFN-γ缺陷[18-19]。总之，肺结核患者外周血和BALF中的T-SPOT.TB 联合检测对于评估肺结核严重程度将有更大的临床意义。

本研究中，肺部影像学显示有空洞的患者323例，T-SPOT.TB检测结果的SFCs数显著高于无空洞组，这与一些学者研究的结果是相反的。Dlugovitzky等[20]比较肺结核不同程度病变范围与IFN-γ水平的关系，发现重度肺结核患者的IFN-γ水平显著低于中度肺结核患者。也有研究显示空洞肺结核患者的IFN-γ释放水平与无空洞肺结核患者比较差异无统计学意义，并且认为空洞是否出现是感染细菌的数量、毒力及机体免疫功能共同作用的结果，结核分枝杆菌的毒力或许对空洞形成的影响更大[18]。因此，我们尚需进行进一步研究，来检测机体免疫细胞的功能。本研究肺部影像学存在钙化的患者为217例，其中钙化<3年的患者T-SPOT.TB结果显著高于钙化>3年的患者(P<0.05)。这在一定程度上说明了当结核病处于活动期时，T-SPOT.TB 检测的SFCs数会在一定程度上呈上升趋势，T-SPOT.TB检测SFCs可以作为结核病是否处于活动期的一个辅助诊断指标。

在机体介导的细胞免疫反应中，单核巨噬细胞是结核分枝杆菌的主要栖居地，也是宿主抗原提呈细胞和抗菌的主要效应细胞；而淋巴细胞是主要的免疫调控细胞，因此，从PBMC研究结核病发病的机体免疫机制具有重要的意义。本研究从血常规检测结果中发现，单核细胞升高组的患者其T-SPOT.TB检测的SFCs数显著高于单核细胞正常组(P<0.01)，这可能与单核细胞的生理功能有关。单核细胞是巨噬细胞的前身，能吞噬、清除受伤衰老的细胞及其碎片；另外还参与免疫反应，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞的特异性免疫反应[21]。由于单核细胞是结核感染免疫的重要起始和效应细胞，因此在活动性结核病中，单核细胞数量会明显上升，这与单核细胞升高组进行T-SPOT.TB检测的SFCs数较高的结果是一致的。另外，淋巴细胞降低组T-SPOT.TB检测的A孔SFCs数明显低于正常组(P<0.01)，这可能是由于结核感染免疫时淋巴细胞大量聚集于结核感染病灶，造成外周循环中淋巴细胞数量下降，活性T淋巴细胞数量减少，最终导致T-SPOT.TB检测的SFCs数较少。

此外，本研究肺结核与肺外结核患者进行T-SPOT.TB检测的SFCs数差异无统计学意义，可能是与检测所用的标本类型有关。本回顾性分析的所有T-SPOT.TB检测数据均来源于外周血，而对于肺外结核来说，对其他类型的标本进行检测往往更有意义[22]。例如，对疑似结核性腹膜炎患者的腹腔积液进行检测，对于结核性胸膜炎患者的胸腔积液进行检测。因此，尚需要对相关类型的标本进行T-SPOT.TB检测来进一步研究后得出结论。

本研究还对同组内T-SPOT.TB检测结果的A孔和B孔SFCs数进行了比较，结果发现除了钙化组之外，其他组内A孔和B孔SFCs数差异均无统计学意义。因此，本研究并未发现人群对CFP-10和ESAT-6两种抗原反应性T-SPOT.TB检测结果的差异有统计学意义，应继续扩大样本量加以证实。

总之，本研究发现T-SPOT.TB检测的SFCs数虽然并不完全与结核病活动程度呈正相关，但仍然存在着结核病活动程度越高SFCs数越多的趋势。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing.WHO Report 2009. Geneva：World Health Organization，2009.

[2] 中华医学会结核病学分会. 肺结核诊断和治疗指南. 中华呼吸和结核杂志，2001，24(2):70-74.

[3] 林玲,刘厚明,邓群益，等. γ干扰素释放试验在肺结核和非结核分枝杆菌肺病鉴别诊断中的应用价值. 中国防痨杂志, 2014,36(6): 477-481.

[4] 刘菲，张宗德，操敏，等. 酶联免疫斑点检测和结核菌素试验在初治肺结核中的辅助诊断价值. 中国医学科学院学报，2009，31(4)：443-448.

[5] Pooran A，Booth H，Miller RF，et al．Different screening strategies (single or dual) for the diagnosis of suspected latent tuberculosis: a cost effectiveness analysis. BMC Pulm Med, 2010, 10:7.

[6] Abdalhamid B，Hinrichs SH，Garrett JL，et al. Utilization of the QuantiFERON-TB Gold test in a two-step process with the tuberculin skin test to evaluate health care workers for latent tuberculosis. J Clin Microbiol,2010, 48(8): 2955-2956.

[7] de Perio MA, Tsevat J, Roselle GA,et al. Cost-effectiveness of interferon gamma release assays vs tuberculin skin tests in health care workers. Arch Intern Med, 2009, 169(2):179-187.

[8] 葛燕萍,肖和平. γ干扰素释放试验与结核菌素皮肤试验辅助检测肺外结核病的比较. 中国防痨杂志, 2014,36(3): 194-197.

[9] Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol, 2002，2(4):251-262.

[10] Kim SH，Choi SJ，Kim HB，et al．Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis．Arch Intern Med, 2007, 167(20):2255-2259．

[11] Kim SH，Song KH，Choi SJ，et al．Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients．Am J Med，2009，122(2):189-195．

[12] 蒋俊.结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验的质量控制与质量保证.中国防痨杂志, 2014,36(5): 380-384.

[13] 李红，方勇，郝晓辉，等. 外周血T-SPOT试验对菌阴肺结核诊断价值的研究//中华医学会结核病学分会.中华医学会结核病学分会 2011 年学术会议论文集.西安：中华医学会结核病学分会，2011：24-29.

[14] Lalvani A, Pathan AA, Durkan H, et al. Enhanced contact tracing and spatial tracking ofMycobacteriumtuberculosisinfection by enumeration of antigen-specific T cells. Lancet, 2001, 357(9273):2017-2021.

[15] Tsao TC, Huang CC, Chiou WK, et al. Levels of interferon-gamma and interleukin-2 receptor-alpha for bronchoalveolar lavage fluid and serum were correlated with clinical grade and treatment of pulmonary tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 2002, 6(8)：720-727.

[16] Oni T，Patel J，Gideon HP，et al．Enhanced diagnosis of HIV-1-associated tuberculosis by relating T-SPOT.TB and CD4 counts ．Eur Respir J，2010，36(3)：594-600．

[17] Bosshard V，Roux-Lombard P，Perneger T，et al．Do results of the T-SPOT.TB interferon-gamma release assay change after treatment of tuberculosis? Respir Med，2009，103(1)：30-34．

[18] 陶学芳，王华钧，王建华，等. 活动性肺结核患者外周血 T-SPOT.TB 测定与细菌学及影像学的关系. 浙江医学，2013，35(23)：2057-2060，2064.

[19] Wang X, Barnes PF, Dobos-Elder KM, et al. ESAT-6 inhibits production of IFN-gamma byMycobacteriumtuberculosis-responsive hummam T cells. J Immunol, 2009，182(6):3668-3677.

[20] Dlugovitzky D, Bay ML，Rateni L, et al. Influence of disease severity on nitrite and cytokine production by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with pulmonary tuberculosis(TB). Clin Exp Immunol，2000，122(3)：343-349.

[21] 王健，赵尔君，孙琳，等．结核杆菌感染外周血单个核细胞对细胞免疫功能的影响. 蚌埠医学院学报，2001，26(3)：194-196.

[22] 周乐亮，沈守荣，何苗，等. 结核感染T细胞斑点试验对结核性腹膜炎的诊断价值. 中南大学学报(医学版)，2013，38(5)：526-531.

(本文编辑：薛爱华)

Clinical analysis of positive T-SPOT.TB in 1873 cases with active tuberculosis

ZHANG Juan, SUN Jiao, LI Ying, WANG Yue, SUN Xiu-hua, MA Jing-hong, XING Li-li, TAN Ke, PENG Jiao, SUN Bing-qi.

Tuberculosis Laboratory, Shenyang Chest Hospital, Shenyang 110044, China

SUN Bing-qi，Email:Sunbq2004@163.com

Objective To explore the relationship between the spot-forming cells (SFCs) of T-SPOT.TB and clinical manifestation of tuberculosis. Methods One thousand eight hundred and seventy three patients with active tuberculosis and T-SPOT.TB positive result were enrolled in this study. The correlation between T-SPOT.TB results and clinical manifestations of tuberculosis patients was compared and analyzed based on the demographic data, bacteriology，imaging characteristics and blood routine examination. Results The median of SFCs of T-spot in primary patients (A:17，B:13)was significantly higher than that of retreatment patients(A: 9，B: 9) (Uvalue of A was 364 391.5，P<0.01；Uvalue of B was 364 259.0，P<0.01)；The median of SFCs of T-spot in young to middle-aged patients (A:17，B: 12)was significantly higher than that in the elderly patients (A: 9，B: 9)(Uvalue of A was 304 368.5，P<0.01；Uvalue of B was 302 802.0，P<0.01)；The median of SFCs of bacteriology positive patients (A: 27，B: 20)was significantly higher than that of bacteriology negative patients(A: 10，B: 10)(Uvalue of A was 298 504.0，P<0.01；Uvalue of B was 279 815.5，P<0.01)；The median of SFCs of patients with cavity in lung(A: 32，B: 25) is higher than that in patients with no cavity in lung(A: 10，B: 9)(Uvalue of A was 208 015.5，P<0.01；Uvalue of B was 216 424.5，P<0.01)；The median of SFCs of patients with higher mononuclear cells (A: 21，B: 20)was significantly higher than that in patients with normal mononuclear cells(A: 10，B: 9)(Uvalue of A was 308 522.0，P<0.01；Uvalue of B was 307 748.0，P<0.01). Conclusion SFCs of T-SPOT.TB cannot be related with tuberculosis activity, but the trends of more high tuberculosis activity level accompany with more SFCs can be found.

Latent tuberculosis/diagnosis； Enzyme-linked immunospot assay

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.013

沈阳市科技计划项目(F12-255-1-00)

110044 沈阳市胸科医院结核病实验室

孙炳奇，Email：Sunbq2004@163.com

2015-02-11)