两种γ-干扰素释放试验方法在结核病诊断中的应用价值比较

卫卫 肖和平 李红 胡海琍 顾瑾 刘一典 桂徐蔚 沈芸郝晓晖 沈彦恒 楼海 王鹏 孙勤 沙巍



·论著·

两种γ-干扰素释放试验方法在结核病诊断中的应用价值比较

卫卫 肖和平 李红 胡海琍 顾瑾 刘一典 桂徐蔚 沈芸郝晓晖 沈彦恒 楼海 王鹏 孙勤 沙巍

目的 对比研究两种γ-干扰素释放试验方法IGRA-ELISA技术和结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB) 在结核病诊断中的应用价值。方法 前瞻性研究纳入2014年1月1日至2014年12月31日在上海市肺科医院结核科门诊及住院诊治的疑似结核病患者81例，最终53例确诊为活动性结核病、28例为非活动性结核病。每例患者分别采用IGRA-ELISA技术和T-SPOT.TB两种方法进行平行检测，采用卡方检验比较两种诊断方法的检测结果，两种方法检测结果一致性评价采用Kappa一致性检验。结果 81例疑似结核病患者中，IGRA-ELISA检测阳性52例，阴性29例；T-SPOT.TB检测阳性54例，阴性27例，两种方法阳性符合率92.6%(50/54)，阴性符合率92.6%(25/27)，总符合率为92.6%(75/81)。两种诊断方法检测结果比较，差异无统计学意义(χ2=55.984,P>0.05)，诊断一致性高(Kappa值=0.836)。IGRA-ELISA技术 和 T-SPOT.TB检测活动性结核病的阳性检出率分别为81.1%(43/53)和84.9%(45/53)，远高于涂片(21.2%，11/52)、核酸检测(16.7%， 6/36)和结核抗体检测(36.5%， 19/52)，两种诊断技术检测非活动性结核病的阴性检出率均为67.9%(19/28)。结论 IGRA-ELISA技术 和T-SPOT.TB检测性能相似，在结核病诊断方面均具有较高的敏感度，对临床有较好的应用价值。

结核/诊断； 干扰素γ释放试验； 酶联免疫吸附测定； 酶联免疫斑点测定

2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示，中国约有600万例活动性肺结核患者[1]，且患者例数逐年增加。国家已出台相关文件要求加强结核病防治工作，要求及早发现、治疗疾病，遏制结核病流行态势的出现。而这无疑对结核病的诊治水平提出了更高的要求。

γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assays，IGRAs)是一种结核分枝杆菌感染检测的新方法，它是基于人体细胞免疫应答机制，在体外用早期分泌靶抗原6(early secretory antigenic target-6，ESAT-6)和培养滤液蛋白10(culture filtrate protein-10，CFP-10))刺激结核分枝杆菌抗原致敏的效应记忆T细胞释放相应的细胞因子，然后通过定量或定性分析系统检测细胞因子(Interferon-γ，IFN-γ)的释放含量变化情况，进而辅助诊断机体是否存在结核分枝杆菌感染。多项研究证实IGRAs在结核感染的诊断中有着很高的敏感度和特异度[2-6]，可作为肺结核的辅助诊断方法，尤其是菌阴肺结核的辅助诊断，同时IGRAs对肺外结核也有着良好的检出效果，可以作为结核分枝杆菌感染筛查的一种手段，可以作为结核病治疗疗效评估较敏感的指标[7]。

目前，北京万泰生产的国产IGRA-ELISA技术 和上海复星代理的进口T-SPOT是国内市场上主流的结核感染T细胞检测试剂。二者的检测结果阳性，均表明患者体内存在结核分枝杆菌，但无法确定是活动性结核病还是潜伏性结核感染，需要结合临床症状及其他诊断方法进行综合判断。

本实验主要为了评价该两种IGRAs方法的临床诊断性能及临床应用价值。

材料和方法

一、标本来源及分组标准

前瞻性纳入2014年1月1日至2014年12月31日在上海市肺科医院结核科门诊及住院诊治的疑似结核病患者共计81例。年龄17～88岁，其中男51例，女30例。入选患者均具有一定的临床症状，临床高度怀疑为结核病。根据临床表现、检测结果及诊断性抗结核治疗最终确诊为活动性结核病53例，非活动性结核病28例。

(一)活动性结核病

1. 肺结核：(1)涂片阳性找到结核分枝杆菌；(2)涂片阴性，经一般抗感染治疗后肺内斑点,斑片，空洞，结节影未吸收，CT提示肺内病灶形态支持结核病的形态学改变；(3)涂片阴性，经诊断性抗结核治疗后， CT复查肺内病灶有吸收；疑似结核病患者符合以上任意1条，即诊断为肺结核。

2. 结核性胸膜炎：腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)明显高于正常值范围，胸腔积液以淋巴细胞为主，胸腔积液中未找到肿瘤细胞，经诊断性抗结核治疗后胸腔积液有吸收，且发病过程中有发热等临床症状，符合以上条件即诊断为结核性胸膜炎。

3. 结核性心包炎：诊断标准与结核性胸膜炎类似。

4. 淋巴结结核：(1)淋巴结活检病理检查，有明确病理依据；(2)淋巴结穿刺涂片，找到结核分枝杆菌；(3)淋巴结穿刺，看到干酪样坏死物，有结核感染倾向，经抗结核治疗，淋巴结缩小或有液化坏死等；疑似结核病患者符合以上任意1条，即诊断为淋巴结结核。

仅符合上述四大项中的第1项，归为肺内结核；仅符合第2～4项中的1项，归为肺外结核；同时符合第1项和第2～4项中至少1项，归为肺内结核合并肺外结核。

(二)非活动性结核病

涂片阴性，排除活动性肺结核的可能性，可能为潜伏性结核感染患者，也可能为非结核性的其他疾病。

二、试剂和仪器

IGRA-ELISA技术试剂盒(北京万泰生物药业股份有限公司)，肝素锂抗凝真空采血管(美国BD公司)，移液器(Thermo)、恒温培养箱(嘉兴中新医疗仪器有限公司)、离心机(上海利鑫离心机有限公司)、洗板机(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)、酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)等。

T-SPOT.TB检测试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司)，Ficoll淋巴细胞分离液、淋巴细胞培养液、磷酸盐缓冲液、台盼蓝染液、肝素锂抗凝真空采血管(美国BD公司)，移液器(Thermo)、Ⅱ级生物安全柜(上海博迅实业有限公司)、离心机(上海耐圣卡兰实业有限公司)、细胞计数设备(上海天承生物科技有限公司)、CO2培养箱(上海博讯实业有限公司)等。

三、实验方法

对入选者用肝素锂抗凝真空采血管采集新鲜全血5 ml，当天同时进行IGRA-ELISA技术T-SPOT.TB检测，每种检测方法与结果判读均严格按照试剂盒说明书进行。

后续跟踪统计分析每位患者进行的痰涂片、核酸、结核抗体等其他结核病检测结果。

四、检测结果的分析与比较

采用SPSS 18.0软件对不同检测方法的检测结果进行统计分析，采用卡方检验，P<0.05为差异具有统计学意义。两种方法结果一致性评价采用Kappa一致性检验，本研究中，Kappa值>0.75表示两种诊断试验一致性好， 0.4

结 果

一、IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测符合性

在81例疑似结核病患者中，IGRA-ELISA技术检测阳性52例，阴性29例；T-SPOT.TB检测阳性54例，阴性27例(表1)。两种试剂阳性符合率92.6%(50/54)，阴性符合率92.6%(25/27)，二者总符合率为92.6%(75/81)。两种诊断方法检测结果比较，差异无统计学意义(χ2=55.984,P>0.05)对两种方法进行一致性检验，Kappa值=0.836，表明两种诊断方法具有较好的一致性。

表1 IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB的检测结果比较(例)

对两种方法中不一致的6例患者进行涂片、核酸和结核抗体检测跟踪统计分析，结果如表2。

二、IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测数值趋势比较

将81例样本的IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB阳性检测数值进行统计分析，发现随着IGRA-ELISA技术[刺激水平(T)-基础水平(N)](T-N)值的升高，T-SPOT.TB的斑点数(无论是A肽还是B肽也随之升高，二者的检测趋势一致。

表2 IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测不符样本各项检测与临床诊断结果列表

注 “/”代表该项检测未做

A肽代表：ESAT-6；B肽代表：CFP-10图1 IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测数值趋势比较

三、不同方法阳性检出率和阴性检出率比较

将所有活动性结核病患者归为1组，检测结果显示：IGRA-ELISA技术、T-SPOT.TB、涂片、核酸、结核抗体检测的阳性检出率分别为81.1%(43/53)、84.9%(45/53)、21.2%(11/52)、16.7%(6/36)、36.5%(19/52)：IGRA-ELISA技术、T-SPOT.TB的阳性检出率远高于涂片、核酸和结核抗体。

将非活动性结核病的患者归为1组，IGRA-ELISA技术、T-SPOT.TB、涂片、核酸、结核抗体检测的阴性检出率分别为67.9% (19/28)、67.9% (19/28)、100.0% (26/26)、94.4% (17/18)、82.1% (23/28)。在非活动性结核病患者中，8例患者IGRA-ELISA技术和T-SPOT.TB检测同时为阳性，且该8例中，结核抗体检测2例阳性。另外，在该组中，核酸检测阳性1例，结核抗体阳性共5例。

IGRA-ELISA技术 与T-SPOT.TB阳性检出率和阴性检出率数据分别进行卡方检验，P值均>0.05，差异均无统计学意义(表3)。

四、不同方法对肺内、外结核患者检测的敏感度比较

将活动性结核病患者进行详细划分，肺结核30例，肺外结核9例，肺结核合并肺外结核14例，无论肺结核、肺外结核还是合并多种结核、IGRA-ELISA技术、T-SPOT.TB的敏感度都远高于涂片、核酸和结核抗体检测(表4)。

五、不同方法对涂阳和涂阴活动性结核病检测的阳性率比较

81例患者中，涂片检测78例，3例未检。该3例用2种方法检测结果一致：1例结核病，IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB均阳性；2例非结核病,IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB均阴性。

53例活动性结核病患者中，涂阳11例，涂阴42例，IGRA-ELISA技术和T-SPOT.TB的阳性率均在90%以上(表5)。

讨 论

近年来，由于IGRAs方法在检测结核病方面具有高敏感度、高特异度、体外全血安全检测的优势，一些IGRAs方法产品在欧盟、美国等发达国家获批，并作为结核分枝杆菌感染筛查和结核潜伏感染筛查的重要检测手段[8]。

一、IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测结果比较

本次对比结果显示，两种方法阳性符合率92.6%(50/54)，阴性符合率92.6%(25/27)，总符合率92.6%(75/81)，二者具有较好的一致性(Kappa值为0.836)，提示基于同一基本检测原理的两种检测方法具有相似的检测性能。

表3 不同方法检测的敏感度和特异度比较

注a：IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB阳性检出率比较，χ2=40.516,P=0.500；b：IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB阴性检出率比较，χ2=0.000,P=0.087；c：涂片、核酸、结核抗体检测数据不完整，对应位置分母为检测例数，分子为阳性或者阴性例数

表4 不同方法对肺结核、肺外结核检测的敏感度比较

注a：IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测的敏感度比较χ2=0.162，P=0.000；b：IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测的敏感度比较，χ2=0.000，P=0.508；c：IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测的敏感度比较，χ2=0.243，P=0.035；d：涂片、核酸、结核抗体检测数据不完整，对应位置分母为检测例数，分子为检测阳性例数

表5 不同方法对涂阳和涂阴活动性结核病的检测阳性率比较

注a：IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB敏感度卡方检验χ2=1.048,P=0.006；b：核酸、结核抗体检测数据不完整，对应位置分母为检测例数，分子为阳性或者阴性例数

对检测结果的统计分析表明，两种方法的检测趋势也是基本一致的。随着IGRA-ELISA技术 T-N 值的升高，T-SPOT.TB的斑点数也随之升高。当IGRA-ELISA技术的T-N值约为50 pg/ml时,与T-SPOT.TB检测斑点数约16个时形成交点，在交点对应数值以下，T-SPOT.TB的斑点数升高幅度较为明显，在交点数值以上，IGRA-ELISA技术的T-N数值升高幅度更为明显。由于存在检测误差，IGRA-ELISA技术和T-SPOT.TB都存在一定的检测灰区，在灰区附近二者检测结果可能存在不一致。

二、IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB的检测性能比较

对于活动性结核病的诊断，IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测阳性率分别为81.1%和84.9%，远高于痰涂片(21.2%)、核酸(16.7%)、结核抗体(36.5%)；IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB检测非活动性结核病患者，阴性检出率分别为67.9%、67.9%，比涂片(100.0%)、核酸(94.4%)、结核抗体(82.1%)结果略低，也略低于文献报道[3-5]。结果的差别除可能与地区差异、入选标本自身情况有关外，还可能与标本的分组有关[9]。在本实验中，阴性检出率的基础值对应的所有非活动性结核病患者不是完全的健康对照，均具有一定的临床症状，故非活动性结核病患者中可能存在一定比例的潜伏结核感染患者。同时，在非活动性结核病患者中，IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB各检出9例阳性患者中，二者检测同时阳性者有8例，且该8例中有2例结核抗体检测为阳性。目前，诊断潜伏性结核感染的传统方法为结核菌素皮肤试验，而研究表明[10-11]，体外IGRAs可以有效地检出潜伏性结核感染。故该8例两种检测方法均阳性的非活动性结核病患者为潜伏结核感染的可能性较大。另外，如32号患者核酸阳性的陈旧性肺结核也归在非活动性结核病组。所以，在该组中IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB的阴性检出率略低。

由于二者采用的是外周血进行体外诊断，肺外结核的检出率略低于肺结核，但仍比涂片、核酸、结核抗体的检出率高。二者对涂阳、涂阴的活动性结核病患者几乎全部检出。故无论肺结核、肺外结核还是合并多种结核，IGRA-ELISA技术和T-SPOT.TB检测技术均可很好的检出，尤其是对菌阴结核病的检出。

三、IGRA-ELISA技术与T-SPOT.TB诊断的临床意义

由于IGRA-ELISA技术和T-SPOT.TB阳性结果无法区分活动性结核病与潜伏性结核感染，故检测结果阳性的潜伏性结核感染患者可根据患者意愿及其他因素综合判断是否需要进行预防性服药。

痰涂片或培养等方法检测肺外结核取样难，且敏感度有限；核酸诊断存在肺外结核患者取样困难的问题；抗体检测采用“胶体金法”对患者外周血进行结核特异性抗体检测，方便快速，对肺外结核诊断亦有帮助，虽有较高的特异度，但敏感度相对低下[12]；而IGRA-ELISA技术和T-SPOT.TB方法具有较高的检出率，又能克服痰涂片、细菌培养、核酸检测肺外结核取样难的弊端，对检测结核感染有较好的应用价值，可以作为结核病的有效辅助诊断方法。

IGRA-ELISA技术和T-SPOT.TB检测性能相似，两者阳性率、敏感度、特异度差异无统计学意义，对检测结核病有较好的应用价值。由于IGRA-ELISA无需分离外周血单个核细胞，对操作人员和仪器设备要求较低，更加适合临床使用和推广。

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(本文编辑：王然 薛爱华)

Comparison of the value of two tuberculosis-IFN-γ release assay kits in the diagnosis of tuberculosis

WEI Wei, XIAO He-ping, LI Hong, HU Hai-li, GU Jin, LIU Yi-dian, GUI Xu-wei, SHEN Yun, HAO Xiao-hui, SHEN Yan-heng, LOU Hai, WANG Peng, SUN Qin, SHA Wei.

Clinic and Research Center of Tuberculosis, Shanghai Key Lab of Tuberculosis, Shanghai Pulmonary Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200433,China

SHA Wei，Email：shfksw@126.com

Objective To evaluate the clinical application value of two interferon-gamma release assay, IGRA-ELISA and T-SPOT.TB, in the diagnosis of tuberculosis (TB). Methods A total of 81 patients with suspected TB who were in clinic or hospitalized in Shanghai Pulmonary Hospital from Jan. 1st, 2014 to Dec. 31th, 2014 were enrolled in this prospective study. Among them, fifty-three patients were diagnosed as active TB, and 28 were diagnosed as non-TB. Each patient was tested by both IGRA-ELISA and T-SPOT.TB. The performance of the two tests was compared by chi-squareχ2test. Consistency of the two tests was compared byKappatest. Results Fifty-two patients were positive and 29 patients were negative using IGRA-ELISA, while 54 patients were positive and 27 patients were negative using T-SPOT.TB. The positive, negative and total coincidence rates of the two tests were 92.6% (50/54), 92.6% (25/27) and 92.6% (75/81), respectively. The two tests were highly consistent (χ2=55.984,P>0.05,Kappa=0.836). The positive rates of IGRA-ELISA and T-SPOT.TB were 81.1% (43/53) and 84.9%(45/53), respectively, which was much higher than those of smear (21.2%，11/52), nucleic acid (16.7%，6/36) and tuberculosis antibody (36.5%，19/52). The negative rates of the two tests in non-TB patients were both 67.9% (19/28). Conclusion Both of IGRA-ELISA and T-SPOT.TB had high sensitivities in the diagnosis of TB and can be used as valuable tools in the diagnosis of TB infection.

Tuberculosis/diagnosis； Interferon-gamma release tests； Enzyme-linked immunosorbent assay； Enzyme-linked immunospot assay

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.011

200433同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心 上海市结核(肺)重点实验室

沙巍，Email：shfksw@126.com

2015-03-09)