卡介苗接种对酶联免疫斑点试验检测结核分枝杆菌感染的影响

白雪娟 梁艳 阳幼荣 王兰 张翠英 张俊仙 吴雪琼



·论著·

卡介苗接种对酶联免疫斑点试验检测结核分枝杆菌感染的影响

白雪娟 梁艳 阳幼荣 王兰 张翠英 张俊仙 吴雪琼

目的 研究卡介苗(BCG)接种对采用重组培养滤液蛋白10(CFP10)-早期分泌靶抗原6(ESAT6)融合蛋白(重组CFP10-ESAT6融合蛋白)进行酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测结核分枝杆菌感染的影响，评价ELISPOT诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值。方法 以结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验为对照，应用重组CFP10-ESAT6 融合蛋白进行ELISPOT检测105名2013年驻京部队入伍新兵外周血中分泌结核分枝杆菌CFP10-ESAT6抗原特异性γ干扰素(IFN-γ)的效应T淋巴细胞斑点数。对PPD和ELISPOT均为阴性的入伍新兵接种卡介苗，3个月后再做PPD试验和ELISPOT。应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析处理，率的比较采用卡方检验，均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果 105名入伍新兵中，PPD试验和ELISPOT阳性率分别为59.0%(62/105)和14.3%(15/105)。43名PPD试验阴性和62例PPD试验阳性者中，分别有6例(14.0%)和9例(14.5%)ELISPOT阳性，两种方法的检测结果差异具有统计学意义(χ2=35.86，P=0.00)，两种方法的一致率为43.8%(46/105)。35名PPD试验和ELISPOT检测均为阴性的入伍新兵卡介苗接种3个月后，PPD试验阳转率为37.1%(13/35)，而ELISPOT检测均为阴性，接种前斑点数[(2.6±3.1)个]与接种后斑点数[(2.6±5.0)个]比较，差异无统计学意义(t=0.52，P=0.61)。结论 ELISPOT检测结核分枝杆菌感染不受卡介苗接种的影响，能更真实地反映驻京部队入伍新兵的结核潜伏感染情况。

潜伏性结核； 卡介苗； 接种； 酶联免疫斑点测定; 重组融合蛋白质类

随着结核病在全球的再次流行，结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)也日益受到重视。LTBI指宿主感染Mtb后的一种特殊状态，感染者体内Mtb处于持留状态，未发生活动性结核病，但具有发展为活动性结核病的风险。目前国内外诊断Mtb感染的方法主要包括PPD试验[或称结核菌素皮肤试验(TST)]及γ干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)[1-3]。国内多采用PPD试验筛查LTBI，但是该方法存在许多缺点，如对于BCG接种过的人和非结核分枝杆菌感染者会出现假阳性，其特异度不高；对于免疫抑制者其敏感度也不高[4]。因此，部分发达国家及结核病低流行的国家已经开始探讨IGRA是否可以代替PPD试验检测Mtb感染[5]；但在发展中国家和结核病高流行国家，例如处于高卡介苗接种率和Mtb高感染率背景下的中国，该技术的研究还处于初期，其应用价值及稳定性需要进一步研究。在前期工作中笔者已成功地利用以Mtb特异性重组培养滤液蛋白10(CFP10)-早期分泌靶抗原6(ESAT6)融合蛋白(重组CFP10-ESAT6融合蛋白)作为刺激原的酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)方法检测了驻京部队战士的Mtb感染[6-7]。本研究采用该技术，进一步研究BCG接种对该方法的影响，以探讨该方法在广泛接种卡介苗情况下的应用价值。

资料和方法

一、 一般资料

研究对象均来源于2013年北京某驻地入伍体检的新兵，均为男性，共计105名，年龄18～21岁，平均(19.5±1.5)岁。胸部X线摄片检查正常，无陈旧性结核病灶，无结核病相关的临床症状及结核病病史，艾滋病病毒抗体检查结果为阴性。并记录有无卡痕。本研究经解放军第三〇九医院医学伦理委员会论证，获得批准实施，受试者均知情同意。

二、主要试剂

TB-PPD购自北京祥瑞生物制品有限公司，卡介苗购自上海生物制品研究所，ELISPOT检测试剂盒为上海铭源数康生物芯片有限公司生产的结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒(F-SPOT)。

三、PPD试验

采用Mantoux法在前臂皮内注射标准TB-PPD 0.1 ml(50 IU/ml)，72 h检查反应结果，PPD试验结果由经过正规预防接种培训的同一人员判读，并记录皮肤反应硬结的平均直径。若硬结平均直径≥5 mm为阳性，≥15 mm为强阳性。

四、ELISPOT检测

采集受试者静脉血5 ml，置肝素钠抗凝管轻轻颠倒混匀，于2 h内送达实验室，4 h内完成外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离。将收集到的静脉血应用淋巴细胞分层液，经密度梯度离心法分离得到PBMC，计数并分别定量至2.5×106/ml。在已包被γ干扰素(IFN-γ)捕获抗体的96孔孵育板内分别加入50 μl细胞培养液(阴性对照)、阳性刺激物植物血凝素(PHA)、Mtb特异性抗原(重组CFP10-ESAT6融合蛋白)；每孔再加入100 μl定量后的细胞悬液，将微孔板放在含5% CO2的培养箱中培养18～20 h；培养结束后依次进行细胞裂解、酶标二抗孵育、生物素链亲和素放大反应、显色及计算机扫描计数分泌IFN-γ的效应T细胞斑点形成细胞数(简称斑点数，spot forming cells，SFCs)。空白孔内斑点数<12个时，实验孔斑点数减去空白孔斑点数≥13个，结果即为阳性；≥30个，结果即为强阳性；若空白孔斑点数≥12个时，实验孔斑点数≥2倍空白孔斑点数，结果即为阳性。

五、BCG接种

在PPD试验及ELISPOT检测阴性新兵的左上臂三角肌外下缘皮内注射BCG 0.1 ml，含卡介菌0.05 mg(5人份/支)，3个月后第二次检查PPD试验结果和进行ELISPOT复查。

六、统计学处理

应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析处理，率的比较采用卡方检验，均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、入伍新兵PPD试验和ELISPOT检测结果

105名入伍新兵中，PPD试验阳性62例(硬结平均直径≥5 mm)，阳性率59.0%(62/105)；强阳性者19例(硬结平均直径≥15 mm)，强阳性率18.1%(19/105)；ELISPOT阳性者15例，阳性率14.3%(15/105)；强阳性者3例，强阳性率2.9%(3/105)，详见表1。

二、入伍新兵PPD试验和ELISPOT检测结果比较

在62例PPD试验阳性者中，9例(14.5%)ELISPOT检测阳性，53名ELISPOT检测阴性；在43名PPD试验阴性者中，6例(14.0%)ELISPOT检测阳性，37名ELISPOT检测阴性；两者的一致率为43.8%(46/105)，两种方法检测结果差异有统计学意义(χ2=35.86，P=0.00)(表2)。

表1 2013年驻京部队105名入伍新兵PPD试验及ELISPOT检测结果

表2 2013年驻京部队105名入伍新兵PPD试验和ELISPOT检测结果比较

三、有卡痕入伍新兵的PPD试验结果

62例PPD试验阳性入伍新兵中，有卡痕者55例(88.7%)，PPD试验阴性者43例，有卡痕者18例(41.9%)。

四、入伍新兵BCG接种对两种检测方法的影响

给35例PPD试验和ELISPOT检测均为阴性的入伍新兵接种BCG， 3个月后再次进行PPD试验和ELISPOT检测。结果13例PPD试验阳性，其中2例呈强阳性，阳转率为37.1%；ELISPOT检测仍然均为阴性。BCG接种前分泌IFN-γ的效应T细胞SFCs为(2.6±3.1)个，接种后SFCs为(2.6±5.0)个，两者间比较差异无统计学意义，t=0.52，P=0.61。

讨 论

目前LTBI的诊断缺乏“金标准”。国内采用的PPD试验反应的是机体对结核菌素纯蛋白衍化物的迟发型变态反应，其包含混合性抗原，因此与Mtb感染、BCG接种和非结核分枝杆菌感染均会产生交叉反应，存在假阳性结果，尤其是在结核病高流行并广泛接种BCG的国家假阳性率更高。我国是结核病高流行国家，且约有76%的新生儿一出生就接种卡介苗[8]，因此PPD试验在我国筛查结核感染时，使用受到很大限制。而ELISPOT检测技术是建立于T细胞免疫基础上的γ干扰素释放试验，可以克服PPD试验的部分缺点，其检测LTBI的特异度高于PPD试验[9-10]。

2007年笔者首次应用以重组CFP10-ESAT6融合蛋白为基础的ELISPOT技术检测了100例入伍新兵的LTBI情况[6]。2009年笔者应用该方法共检测1273例驻京部队入伍新兵LTBI的情况[11-12]，本研究在既往研究的基础上进一步对105例驻京部队入伍新兵的LTBI现状进行调查，并且进一步了解BCG接种对该技术的影响，评价该技术在中国广泛接种卡介苗的人群中的反应情况。

2003—2006年驻京部队入伍新兵的PPD试验阳性率为49.9%[13]，2007年为41.0%[6]；2009年PPD试验阳性率达到44.81%～50.2%[11-12]；而2013年入伍新兵的PPD试验阳性率为59.0%，高于以往水平，可能由于这批新兵卡介苗接种水平较高，PPD阳性者中88.7%接种了卡介苗。ELISPOT检测阳性率仅为14.3%，进一步说明PPD阳性人群中存在由于BCG接种及其他原因导致的假阳性。PPD试验和ELISPOT检测结果比较，发现两种检测方法不具有相关性，这与以前研究结果一致[11-12，14]。本实验中PPD试验对动态的CFP10-ESAT6融合蛋白进行ELISPOT检测没有影响，因为35例PPD试验与ELISPOT检测均阴性者接受BCG接种前后的ELISPOT检测结果均为阴性。但前一次PPD试验对后一次PPD试验可能有影响，理论上2次检测用了同一抗原，后一次反应会受到前一次免疫的影响；本研究BCG接种3个月后PPD试验阳转的受试者中，不能排除有些受试者对前一次PPD试验产生了免疫记忆反应。

本研究对PPD试验及ELISPOT检测阴性者接种BCG，3个月后复查PPD的阳转率仅为37.1%，显著低于李兵等[14]的研究报道，其对27名年龄18～20岁、PPD试验及ELISPOT检测均为阴性的高校学生接种BCG，接种量为0.1 ml(含菌0.5 mg～0.75 mg)，3个月后发现PPD的阳转率达到100%。在本研究中笔者使用了制剂推荐的接种量，即0.1 ml(仅含卡介菌0.05 mg)，未能诱导足够强的反应，导致3个月后PPD阳转率较低；随着时间延长，PPD阳转率将会逐渐提高；如笔者之前的研究显示，BCG接种后7、10个月的阳转率(77.3%、78.18%)明显高于本研究[11-12]。目前我国儿童计划免疫要求新生儿接种卡介苗，而我国鲜有报道在成年人中进行BCG接种，因此，我国生产的卡介苗制剂都是适用于儿童的，经过长期临床应用证明是安全、有效的，引发的不良反应少。本研究按推荐剂量进行成人接种，BCG接种量少，未能诱导足够强的反应。由此可见，PPD的阳转率与BCG接种剂量及接种后时间有关，接种剂量增多和时间延长，阳转率会提高。此外，不同研究结果的差异也可能因为BCG的生产厂家、批次不同或接种人员接种手法不同所致。

CFP10或ESAT6存在于结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌基因组的RD1区中，但在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌基因组中缺失。因此，应用重组CFP10-ESAT6融合蛋白作为ELISPOT试验的刺激剂理论上不受卡介苗接种的影响。本研究结果证实了这一点，利用该融合蛋白对BCG接种前后人群的PBMC进行体外刺激，诱导分泌IFN-γ的效应细胞数目在BCG接种前后基本相当，并没有受到BCG接种的影响，这一结果与笔者之前报告的卡介苗接种10个月后的结果一致[12]，可见重组CFP10-ESAT6融合蛋白作为ELISPOT试验的刺激剂在长期及短期时间内都不受卡介苗接种的影响。

综上所述，与PPD试验相比较，以重组CFP10-ESAT6融合蛋白作为刺激剂进行ELISPOT检测能更真实地反映驻京部队入伍新兵的LTBI情况，而且不受卡介苗接种的影响。本方法的普及和推广，对于部队乃至全国的LTBI筛查及结核病的防控工作具有现实的意义。

[1] 万荣, 李明武, 赖明红，等.结核感染T细胞斑点试验在老年肺结核中的诊断价值.中国防痨杂志, 2015,37(4): 348-352.

[2] 施雯慧, 成诗明, 陈伟. 结核潜伏性感染诊断研究进展.疾病监测，2012,27(3):242-247.

[3] 王立红，付秀华，张桂芝，等. 结核感染T细胞斑点试验在结核病诊断中的应用价值. 中国防痨杂志， 2013，35(12): 992-996.

[4] 彭超, 王洪海. 结核分枝杆菌潜伏感染诊断方法的新进展.生物技术通讯，2010,21(1):107-111.

[5] Arias Guillén M. Advances in the Diagnosis of Tuberculosis Infection. Arch Bronconeumol， 2011,47(10):521-530.

[6] Wu X, Li Q, Yang Y, et al. Latent tuberculosis infection among new soldiers in Chinese army: comparison of ELISPOT assay and tuberculin skin test.Clin Chim Acta,2009,405(1-2):110-113.

[7] Wu X, Liang Y, Wang L, et al. Latent tuberculosis infection among new recruits to the army in Beijing, China in 2009. APMIS,2011,119(6):377-384.

[8] National Technical Steering Group of the Epidemiological Sampling Survey for Tuberculosis, Duanmu H. Report on fourth national epidemiological sampling survey of tuberculosis. Chin J Tuberc Respir Dis, 2002, 25(1): 3-7.

[9] Diel R, Loddenkemper R, Meywald-Walter K, et al. Compara-tive performance of tuberculin skin test, QuantiFERON-TBGold in tube assay, and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis. Chest, 2009,135(4):1010-1018.

[10] Connell TG, Ritz N, Paxton GA, et al. A three-way comparison of tuberculin skin testing, QuantiFERON-TB Gold and T-SPOT.TB in children. PLoS One,2008,3(7):e2624.

[11] 王兰,梁艳,吴雪琼, 等. 2009年驻京部队入伍新兵结核感染及随访情况分析.解放军医学杂志，2012,37(8):827-832.

[12] 梁艳,吴雪琼,王兰, 等. 应用酶联免疫斑点试验检测入伍新兵结核潜伏感染.中国感染控制杂志，2011,10(4):244-247.

[13] Zhang C, Dong E，Zhu I，et al. Tuberculosis infection survey in new recruits to the army in Beijing (2003—2006). J Prev Med Chin PLA, 2007,25(3):188-189.

[14] 李兵, 陈献雄, 杨倩婷. 卡介苗对结核分枝杆菌IFN-γ酶联免疫斑点检测法的影响.临床肺科杂志，2010,15(7):955-957.

(本文编辑：王然 薛爱华)

The impact of BCG vaccination on tuberculosis infection detection with ELISPOT assay

BAI Xue-juan, LIANG Yan, YANG You-rong, WANG Lan, ZHANG Cui-ying, ZHANG Jun-xian, WU Xue-qiong.

Army Tuberculosis Prevention and Control Key Laboratory, Beijng Key Laboratory of New Techniques of Tuberculosis Diagnosis and Treatment, Institute for Tuberculosis Research, the 309th Hospital of Chinese PLA, Beijing 100091, China

WU Xue-qiong, Email: wu-xueqiong@263.net

Objective To study the impact of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) vaccine on enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay usingM.tuberculosisrecombinant CFP10-ESAT6 protein, and evaluate the application value of ELISPOT on diagnosis of latent tuberculosis infection (LTBI). Methods A total of 105 new recruits in Beijing in 2013 were intradermally injected with purified protein derivative (PPD)，and detected with ELISP0T assay using recombinant CFP10-ESAT6 fusion protein as a stimulus. New recruits with negative ELISPOT assay and negative PPD skin test were vaccinated by intradermal injection with BCG vaccine, and detected by PPD skin test and ELISPOT assay again 3 months later. The statistic analyses were performed using SPSS 18.0. The Chi-square test was used to assess the difference between rates, and theTtest was used to assess the difference between the average.Pvalue <0.05 was considered to be significantly different. Results Of 105 new recruits，the positive rates of PPD skin test and ELISPOT assay were 59.0% (62/105) and 14.3% (15/105), respectively．Of 43 PPD-negative and 62 PPD-positive new recruits, 6 (14.0%) and 9 (14.5%) were ELISPOT-positive, respectively.The results of these two methods had significant difference (χ2=35.86,P=0.00). Their agreement rate was 43.8% (46/105). Of 35 new recruits vaccinated by BCG vaccine 3 months later, 37.1% (13/35) were PPD-positive, but all of them were ELISPOT-negative. There was no statistical difference between the levels of IFN-γ before (2.6±3.1) and after (2.6±5.0) BCG vaccination (t=0.52,P=0.61). Conclusion BCG vaccination has no obvious impact on the ELISPOT assay, which is more feasible for the screening of LTBI in new recruits in Beijing.

Latent tuberculosis； BCG vaccine; Vaccination； Enzyme-linked immunospot assay; Recombinant fusion proteins

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.008

“十二五”全军医学科研重点项目(BWS11J050)；“十二五”国家重大科技专项(2013ZX10003003-005)

100091 北京，解放军第三〇九医院全军结核病研究所 全军结核病防治重点实验室 结核病诊疗新技术北京市重点实验室

吴雪琼，Email: wu-xueqiong@263.net

2015-02-10)