全血γ-干扰素释放试验在继发性肺结核中的辅助诊断价值

王兴亮 刘娟 费忠亭 高爱忠 陈震 刘兴祥



·论著·

全血γ-干扰素释放试验在继发性肺结核中的辅助诊断价值

王兴亮 刘娟 费忠亭 高爱忠 陈震 刘兴祥

目的 研究分析全血γ-干扰素释放试验(the whole blood interferon gamma release assay in vitro，IGRA-ELISA)在继发性肺结核中的辅助诊断及临床应用价值。方法 前瞻性纳入2012年8月至2013年6月淮安市第四人民医院143例疑似活动性肺结核患者，包括110例活动性肺结核患者，其中继发性肺结核66例，和33例非结核病患者进行IGRA-ELISA、结核抗体、抗酸染色和结核分枝杆菌培养检测。采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析，计数资料采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。 结果 在继发性肺结核中，IGRA-ELISA敏感度为90.9%(60/66)，均高于结核抗体检测(57.6%，38/66)、抗酸染色检测(16.7%，11/66)，且IGRA-ELISA与另两种方法敏感度比较差异有统计学意义(χ2=1.588,P=0.000；χ2=1.320，P=0.000；χ2=6.005，P=0.000)。特异度方面3种检测方法均在90%以上，分别为93.9%(31/33)，93.9%(31/33)，90.9%(30/33)，IGRA-ELISA、结核抗体与抗酸染色检测方法特异度两两比较，差异无统计学意义(χ2=7.220，P=1.000；χ2=4.311，P=1.000；χ2=0.213，P=1.000)。细菌培养阳性的继发性肺结核患者中，IGRA-ELISA阳性率为96.0%(24/25)，而培阴的继发性肺结核患者中IGRA-ELISA阳性率为87.8%(36/41)。结论 相比其他检测方法，IGRA-ELISA在继发性肺结核诊断中的敏感度和特异度最高，可作为继发性肺结核辅助诊断的有效依据，尤其是培阴继发性肺结核患者的辅助诊断。

干扰素γ释放试验； 结核, 肺/诊断； 酶联免疫吸附测定； 敏感性与特异性

《2014年全球结核病报告》显示：2013年全球有900万例结核病新发患者， 150万例死亡。中国是结核病的高发区，结核病发病例数居全球第二。《2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告》估算，全国有600万例活动性肺结核患者，且患者例数逐年增加，形势依然严峻[1]。

继发性肺结核是我国肺结核的主要发病类型，是由于结核分枝杆菌再次感染而导致的肺结核，此类病变常常始于肺尖，形成再感染灶，多数是患者体内之前潜伏的结核分枝杆菌复燃，少数为患者再次感染外源性结核分枝杆菌。继发性肺结核易形成干酪样坏死和空洞，排菌者较多，在流行病学上具有重要意义。

目前对于继发性肺结核的诊断主要有影像学、细菌学、病理学、免疫学方法。从病理学和影像学形态特点可对继发性肺结核进行细致的区分，对鉴别诊断有一定帮助，但对治疗意义不大，且病理学检查需要进行创伤性取样；痰涂片敏感度低，细菌培养时间周期过长，制约着结核病诊断的有效性和时效性；核酸检测等技术由于成本和技术的复杂性等问题使其在医学检验实验室较难展开；传统的结核菌素试验的结果不能够区分非结核分枝杆菌感染和卡介苗接种[2-4]，故寻找一种准确、快速、可靠的方法诊断继发性结核病十分重要。

材料和方法

一、患者来源和分组

前瞻性纳入2012年8月至2013年6月在淮安市第四人民医院门诊及住院诊治的疑似活动性肺结核患者共143例，男101例，女42例，年龄中位数43岁。

(一)继发性肺结核组患者入组标准与一般情况介绍

1．入组标准：(1)感染过结核分枝杆菌，结核病第2次暴发；(2)胸片在肺上叶尖后段、肺下叶背段等处呈多种混合形态(同时呈现渗出、增殖、纤维和干酪性病变)等有继发性肺结核的疑似特征；(3)痰培养阳性，或痰培养阴性但患者有活动性肺结核的症状和体征，且临床诊断性抗结核治疗有效。满足上述2条以上则诊断为继发性肺结核组。

2.一般情况介绍：入组活动性肺结核组的患者110例，其中继发性肺结核66例，占肺结核患者60.0%(66/110)；男性占81.8%(54/66)。从年龄分布来看，未成年人占6.1%(4/66)；青壮年占78.8%(52/66)；老年人占15.2%(10/66)。

(二)非结核病组患者入组标准与一般情况介绍

1.入组标准：临床表现明确系其他疾病所致的，或者经其他治疗(未经抗结核治疗)病情改善的。

2.一般情况介绍：入组非结核病组的患者共计33例，男性15例，女性18例，具体分组及各组年龄组成见表1。

二、试剂和仪器

改良罗氏培养基(上海伊华科学技术有限公司出品)，高压灭菌后的4%氢氧化钠(NaOH)溶液，生理盐水，结核感染T细胞检测试剂盒(体外释放酶联免疫法)(IGRA-ELISA)(北京万泰生物药业股份有限公司出品)，结核分枝杆菌抗体检测试剂盒(胶体金法)(上海奥普生物医药有限公司出品)，抗酸染色试剂(珠海贝索生物技术有限公司出品)；离心机(TDZ5B-WS，上海卢湘仪公司出品)、恒温培养箱(HH-420，上海乔跃电子有限公司出品)、酶标仪[IMARK，美国伯乐(Bio-Rad)公司出品]

三、检测方法

1.结核分枝杆菌培养：样本先用4% NaOH溶液进行预处理，后弃去上清，沉淀中加入0.9%的生理盐水，颠倒混匀后1500×g离心10 min，重复该操作2次；之后沉淀混匀后取100 μl无菌接种在改良罗氏培养基上，37 ℃平卧放置斜面24 h；然后，拧紧培养瓶盖，直立放置继续培养。每周观察1次菌落生长情况，做好记录，有菌落生长需经抗酸染色确认是否为抗酸杆菌。若至第8周仍无菌落生长，方可报告阴性结果。

2.IGRA-ELISA：取肝素抗凝血4 ml，在2 h内分装至阴性对照管N、检测管T、阳性对照管P，3种培养管中，于37 ℃恒温培养箱中培养(22±2) h，1500×g离心10 min，取血浆进行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。具体检测操作按试剂说明书进行(双抗体夹心法)。

表1 两组患者性别与年龄分布(例)

3.结核分枝杆菌抗体检测(胶体金法)：在反应板的反应孔中间，加入2滴封闭液(20%山羊血清和pH 7.4磷酸盐缓冲)，取40 μl新鲜的血清标本，加入反应孔中间，再在反应孔中间加入6滴洗涤液(0.1%吐温和pH 7.4磷酸盐缓冲液)、2滴金标液(胶体金缀合物)、6滴洗涤液(0.1%吐温和pH 7.4磷酸盐缓冲液)，等待薄膜吸入，目测判读结果。具体检测操作按结核抗体试剂说明书进行。

4.抗酸染色检测：在涂片标本上先滴加石炭酸复红进行初染，再用3%盐酸酒精脱色，之后用碱性美蓝溶液复染，水洗后用吸水纸吸干后观察。

四、统计学处理

采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析，计数资料采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、3种结核病诊断检测方法的比较

对入组患者行IGRA-ELISA、结核抗体、抗酸染色3种检测。在继发性肺结核组中，IGRA-ELISA、结核抗体、抗酸染色检测敏感度分别为90.9%(60/66)、57.6%(38/66)、16.7%(11/66)，具体见表2。

对非结核病组进行3种方法检测，分别是IGRA-ELISA、结核抗体、抗酸染色检测特异度分别为93.9%(31/33)、93.9%(31/33)、90.9%(30/33)，具体见表2。

表2 3种检测方法在2组患者中的结果比较

注 (1) IGRA-ELISA与结核抗体敏感度比较，χ2=1.588,P=0.000; (2) IGRA-ELISA与抗酸染色敏感度比较，χ2=1.320,P=0.000; (3) 结核抗体与抗酸染色敏感度比较，χ2=6.005,P=0.000; (4) IGRA-ELISA与结核抗体特异度比较，χ2=7.220,P=1.000; (5) IGRA-ELISA与抗酸染色特异度比较，χ2=4.311,P=1.000; (6) 结核抗体与抗酸染色特异度比较，χ2=0.213,P=1.000

二、IGRA-ELISA与细菌培养检测结果的比较

细菌培养阳性而确定的继发性肺结核有25 例，占继发性肺结核的37.9%(25/66)。细菌培养阳性的继发性肺结核患者采用IGRA-ELISA技术检测的阳性率达到96.0%(24/25)，而细菌培养阴性的继发性肺结核患者41例采用IGRA-ELISA技术检测的阳性率也达到了87.8%(36/41)。

讨 论

结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病，仅活动性结核病患病率就高达367/10万例，但结核病检出率仅为39%[2]。因此通过快速诊断活动性结核病是结核病预防控制项目的重点，但已有的常规检测很难达到这一点[3]，传统的结核菌素皮肤试验特异度差，外加对于免疫抑制的患者缺乏足够的敏感度而导致假阴性。近年来，研究表明全血γ-干扰素释放试验在检测在活动性肺结核、肺外结核的敏感度、特异度优于结核菌素试验[4-7]。

一、IGRA-ELISA技术检测原理

本研究所采用的IGRA-ELISA技术，其原理是利用结核分枝杆菌特有的基因RD1区域编码的2个特异性蛋白早期分泌靶抗原-6(early secretory antigenic target-6，ESAT-6)和培养滤液蛋白-10(culture filtrate protein-10，CFP-10)作为刺激抗原诱导全血标本中结核抗原特异性记忆T淋巴细胞产生特异的免疫应答，间接检测应答所产生的γ-干扰素(IFN-γ)，国内外已有文献报道其灵敏度和特异度强[5-8]。由于IGRA-ELISA技术检测的是T细胞介导的IFN-γ反应，因此不仅可检测肺结核，同时适用于肺外结核检测。基于IGRA-ELISA技术在敏感度和特异度上的优势，近年来，大量具有相同原理的技术在欧盟、美国等发达国家获得批准，并作为结核感染筛查和结核潜伏感染筛查的重要检测手段[5-6,9]。本研究所用的IGRA-ELISA技术是已在国内获得批准的应用于全血γ-干扰素释放试验的检测技术。

二、IGRA-ELISA技术在继发性肺结核中的检测结果分析

本研究将IGRA-ELISA技术应用于继发性肺结核检测中，以观察其辅助检测性能。以继发性肺结核患者为对象，对IGRA-ELISA技术与结核抗体、抗酸染色检测方法进行比较， IGRA-ELISA技术的敏感度(90.9%，60/66)明显高于结核抗体(57.6%，38/66)和抗酸染色(16.7%，11/66)，差异有统计学意义(χ2=1.588,P=0.000；χ2=1.320，P=0.000，χ2=6.005，P=0.000，)，IGRA-ELISA技术的敏感度同时也高于结核病检测的金标准——细菌培养(37.9%，25/66)的检出率，提示IGRA-ELISA技术检测继发性肺结核的敏感度高；而对非结核病组检测时，几种检测方法特异度均在90%以上。另外，IGRA-ELISA技术检测菌阳的继发性肺结核患者的阳性率为96.0%(24/25)，而对菌阴继发性肺结核检测的阳性率为87.8%(36/41)：IGRA-ELISA检测在继发性肺结核中具有较高的敏感度和特异度，与国内外报道一致[10-12]，提示其对继发性肺结核的辅助诊断具有重要意义，尤其是在细菌培养阴性的继发性肺结核患者的辅助诊断上。

抗酸染色检测是世界范围内结核病检查中使用最广泛的技术，局限性在于敏感度差，受痰样本和病情的影响，同时抗酸染色阳性中约12%是由于非结核分枝杆菌引起[1]。本研究中抗酸染色敏感度仅为16.7%，远低于文献报道的50%～60%[13]，特异度则高达90.9%，可能与入选的患者样本有关。

同时，笔者在临床中总结发现：结核分枝杆菌感染机体，患者血清中有特异性抗体形成，检测抗体对结核病有辅助诊断价值，但无论是对肺结核还是肺外结核的诊断，现有的商品化血清学检测方法均未达到理想的诊断效果，并且在不同人群和地区存在较大的差异性。细菌培养常作为结核病检测的金标准，但其敏感度较低，且培养周期较长。IGRA-ELISA技术在该研究中相比其他方法，特异度一致，敏感度远高于其他方法，有明显的优势，这是与该方法细胞免疫的原理及技术平台相匹配的。

IGRA-ELISA技术在继发性肺结核检测中表现出良好的检测结果，且具有操作简单方便的特点，适合临床作为继发性肺结核检测的辅助诊断工具。

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(本文编辑：王然 薛爱华)

Auxiliary diagnostic value of the whole blood gamma release assay in vitro for secondary pulmonary tuberculosis

WANG Xing-liang, LIU Juan, FEI Zhong-ting, GAO Ai-zhong, CHEN Zhen, LIU Xing-xiang.

Medical Testing Center，Huai’an No. 4 People’s Hospital, Jiangsu 223300, China

LIU Xing-xiang，Email：halxx@163.com

Objective To evaluate the auxiliary diagnostic value of the whole blood interferon gamma release assay in vitro (IGRA-ELISA) in the patients with secondary pulmonary tuberculosis (TB). Methods One hundred and forty three cases of suspected patients with active pulmonary TB, from August in 2012 to June in 2013 in Huai’an No. 4 People’s Hospital, were divided into groups and examined with IGRA-ELISA test, anti-TB antibody test, sputum smear and mycobacterial culture. There were 110 cases with active pulmonary TB (including 66 cases with secondary pulmonary TB), and 33 cases with nonTB disease-. SPSS 18.0 was used for statistical analysis, the chi square test was used for counting data, andP<0.05 was statistically significant. Results Of the patients with secondary pulmonary TB, the sensitivity of the IGRA-ELISA test (90.9%, 60/66) was the highest of among the three tests,the sensitivities of anti-TB antibody test and sputum smear were 57.6% (38/66) and 16.7% (11/66), respectively. They were dramatically different (χ2=1.588,P=0.000；χ2=1.320，P=0.000，χ2=6.005，P=0.000)．The specificities of all the three tests were over 90% (93.9%, 31/33; 93.9%, 31/33; 90.9%, 30/33), and there were no great difference (χ2=7.220，P=1.000；χ2=4.311，P=1.000，χ2=0.213，P=1.000). The positive rates of IGRA-ELISA in culture-positive and culture-negative patients with the secondary pulmonary TB were 96.0% (24/25) and 87.8% (36/41), respectively. Conclusion Compared with other methods, the IGRA-ELISA test enjoyed the highest sensitivity and specificity in clinical application. It could be used as an auxiliary diagnostic method for the secondary pulmonary TB, especially in culture-negative pulmonary TB.

Interferon-gamma release tests； Tuberculosis, pulmonary/diagnosis; Enzyme-linked immunosorbent assay； Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.010

223300 江苏省淮安市第四人民医院医学检验中心(王兴亮、刘娟、刘兴祥)，结核科(费忠亭、高爱忠、陈震)

刘兴祥，Email：halxx@163.com

2015-02-13)