γ干扰素释放试验与结核菌素皮肤试验在肺结核患者密切接触者随访中的应用比较

李晋 杨倩婷 岳建荣 林玲 张明霞 顾美红 邓群益 邓国防 邓永聪 陈心春



·论著·

γ干扰素释放试验与结核菌素皮肤试验在肺结核患者密切接触者随访中的应用比较

李晋 杨倩婷 岳建荣 林玲 张明霞 顾美红 邓群益 邓国防 邓永聪 陈心春

目的 比较γ干扰素释放试验(IGRAs)和结核菌素皮肤试验(TST)在筛查肺结核密切接触者是否发生结核感染中的效能。方法 对138名肺结核患者的密切接触者[分别为家属(60名)和同事(78名)]每6个月进行酶联免疫斑点试验(ELISPOT)和TST平行检测，同时了解结核病的发生情况，共随访24个月；统计分析ELISPOT和TST检测结果与疾病发生和结核分枝杆菌暴露的关系。结果 在2年的随访中，累计发现11例新发活动性肺结核。与127名完成2年共5次随访的未发病密切接触者相比，新发活动性肺结核发病人群第一次ELISPOT检测的阳性率为72.7%(8/11)，显著高于未发病人群的阳性率33.1%(42/127)，χ2=6.8905，P=0.0087；而TST检测的阳性率分别是63.6%(7/11)、66.9%(85/127),χ2=0.0494，P=0.8241，差异无统计学意义。ELISPOT阳性率与结核分枝杆菌暴露程度有关，暴露程度较高的密切接触者(家属)的阳性率为45.0%(27/60)，显著高于暴露程度较低的同事[28.2%(22/78)]，χ2=4.1773，P=0.0410；而TST检测的阳性率分别为55.0%(33/60)和75.6%(59/78)，与结核分枝杆菌暴露程度不一致。 结论 ELISPOT筛查肺结核密切接触者中高危人群的特异度显著高于TST，能更准确地反映结核分枝杆菌暴露后的感染情况。

结核,肺/诊断； 接触者追踪； 干扰素γ释放试验； 结核菌素试验； 酶联免疫斑点测定； 随访研究

筛查肺结核密切接触者是否发生结核感染，并对潜伏结核感染者(latent tuberculosis infection, LTBI)进行预防性化疗，是根除结核病的一个重要措施，也是当前一些结核病低流行的发达国家采用的结核病防控策略。我国是结核病高负担国家，早期发现和治疗活动性肺结核患者以减少社区的传播显得十分重要。而由于潜伏感染人群巨大，以及患者对预防性化疗的依从性差，至少短期内很难实施LTBI的干预化疗。在潜伏感染人群中，约10%进展为活动性结核病，这些新发结核病患者进而造成新的传播，从而影响结核病的控制效果。因此，如何从LTBI中筛选出可能进展为活动性结核病的个体进行预防性化疗，对于实现结核病彻底控制的目标具有重要意义。

结核菌素皮肤试验(TST)和γ干扰素释放试验(IGRAs)是当前用于LTBI诊断的两种主要技术。由于结核病的流行情况等多种因素影响，不同地区对于两种方法在LTBI诊断的应用方面存在不同的意见，在具体的应用中两种技术可能各有优势。 另一方面，肺结核患者密切接触者是结核分枝杆菌感染和发生结核病的高危人群。为此，笔者通过对密切接触者的定期随访，比较IGRAs和TST对结核病密切接触者人群中筛查LTBI的应用价值。

资料和方法

一、研究对象

2010—2014年间来我院就诊的活动性肺结核患者的密切接触者，在肺结核患者发现的2周以内，每6个月随访检测1次结核感染和发病情况，包括酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)检测、TST检测、胸片，以及临床症状等[1]。 本研究仅对完成5次随访的138名受试者进行统计分析。其中密切接触者纳入标准:(1)自愿参加随访，签署知情同意书；(2)在活动性肺结核患者治疗之前与其一起居住、密切接触6个月以上(家庭成员、同一办公室同事)；(3)入组时年龄>14周岁；(4)排除机体免疫缺陷疾病(先天性免疫缺陷、HIV感染)、重度营养不良及免疫抑制剂使用者。本研究获得深圳市第三人民医院伦理委员会的审查和批复。

二、主要试剂

1.TST 检测标准PPD：购于四川成都生物制品研究所。

2.ELISPOT 检测的主要试剂: 包被抗体(anti-human IFN-γ)、检测抗体(affinity purified anti-human IFN-γ) 及 酶 联 二 抗 (streptavidin，alkalin phosphatase conjugated anti-IgG)，前两者购自 eBioscience公司(美国)，后者购自 Pierce公司(美国)；碱性磷酸酶底物显色试剂盒[对甲苯胺蓝(BCIP)+四唑硝基蓝(NBT),BCIP+NBT]购自Thermo(美国)；而 ELISPOT 检测中所使用的结核菌重组蛋白早期分泌抗原靶6(ESAT-6)为深圳市第三人民医院肝病研究所自行制备[2-3]；重组培养滤液蛋白10(CFP-10)-ESAT-6融合蛋白(重组CFP-10-ESAT-6融合蛋白，简称“多肽抗原”)由深圳瀚宇生物技术公司合成，纯度超过 95%。ELISPOT读数系统(Bioreader 4000 Pro-X) 为德国BioSys公司产品。

3.痰涂片主要材料:痰涂片所需黏附载片(超白玻璃，高清洁度，规格：25 mm×75 mm，厚度：1～1.2 mm)，购于江苏省世泰实验器材有限公司。

三、方法及步骤

1.一般要求：所有的密切接触受访者均要求进行胸部X线检查、ELISPOT及TST检测。胸部X线检查有异常者，结合其临床症状、病史开展相应的相关辅助检查、综合检查，以及临床治疗情况由传染病专科医生排除其他疾病的可能性；参照2001年中华医学会结核病学分会制定的《肺结核诊断和治疗指南》标准，确定肺结核诊断。

2.ELISPOT 检测：采集密切接触者外周全血5 ml(肝素锂抗凝)，分离外周血单个核细胞(PBMCs)，在预先包被好的抗体的平板中加入细胞100 μl/孔，每孔细胞浓度为2×105个细胞。阴性对照孔中不加任何刺激物；阳性对照每孔加入自然凝集素(PHA)5 μg,终浓度5 μg/ml；实验孔加入本实验室自行制备的抗原ESAT-6及多肽抗原，终浓度为每孔5 μg/ml。继而移至 5% CO2培养箱 37 ℃培养 16～24 h。第二天洗板后，先加入检测抗体于CO2培养箱孵育 1 h，然后洗板，再加入亲和素继续CO2培养箱孵育 1 h，继而洗板，最后加入显色剂显色。待显色洗板后，采用酶联斑点图像分析仪读数，记录斑点数量。按照 ELISPOT 试剂说明书及根据前期ROC曲线，以ESAT-6蛋白抗原孔中形成的斑点形成细胞(SFCs)≥40个，或多肽抗原孔中SFCs≥30 个判断为阳性[4]。

3.TST检测方法：采血后由深圳市第三人民医院结核病区有经验的医院工作人员在密切接触者左侧前臂内侧皮内注射由四川生物制品公司生产的标准PPD 0.1 ml(含 BCG PPD 5 IU)，使局部形成皮丘。48～72 h 后，记录硬结平均直径。按硬结平均直径≥15 mm为阳性[5]。

四、统计学方法

对于配对样本进行ELISPOT及TST检测结果的统计，采用配对四格表统计分析；对于两组间的差别，采用非配对t检验；对于等级资料，采用行列表进行统计分析，均以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、138名结核病密切接触者的随访情况

在随访周期内，累计发现11例新发活动性结核病患者，其中男∶女=1.75∶1 (7/4)，平均年龄(27.64±17.76)岁。 完成2年5次随访未发病的密切接触者127名，其中男∶女=1.44∶1 (75/52)，平均年龄(28.34±13.66)岁。新发活动性肺结核ELISPOT、TST及结核分枝杆菌暴露程度(与传染源的关系),详见表1。

二、未发病人群和新发病人群中ELISPOT及TST检测的结果比较

比较随访2年间未发病和发病的两组人群第一次(随访的第1个月)ELISPOT 和TST检测结果，ELISPOT检测阳性率分别为33.1%和72.7%，差异具有显著统计学意义(P=0.0087)；而TST 检测阳性率分别为66.9%和63.6%，差异无统计学意义(P=0.8241)(表2)。

三、ELISPOT与TST检测结果与结核分枝杆菌暴露程度的关系

结核感染和结核病的发生与结核分枝杆菌暴露程度密切相关[2,6]，为了探讨ELISPOT与TST检测结果与结核分枝杆菌暴露程度的关系，笔者比较了暴露程度显著差别的家属和同事ELISPOT与TST检测的阳性率(表3)。虽然本研究未能精确计算家属和同事的具体暴露时间，但已有资料表明家属的结核分枝杆菌暴露程度显著高于同事。与此一致，笔者发现11例新发患者中8例为家属，而只有3例是同事，尽管完成2年随访的人群中家属人数(60名)少于同事(78名)。值得注意的是：虽然TST和ELISPOT检测阳性率在家属和同事中差异均有统计学意义，但两者检测结果的方向截然相反(表3)，暴露程度较高的家属TST检测阳性率反而低于暴露程度较低的同事。

表1 新发活动性肺结核患者情况一览表

注 根据第7版《传染病学》表中胸片诊断Ⅲ型肺结核即为继发性肺结核，分子代表左肺，分母代表右肺，上、中、下代表左右肺的结核发生位置，(-/+)代表影像学的阴/阳性

表2 结核病接触者第一次随访ELISPOT及TST检测结果比较

注 表中括号内数值分子为阳性例数，分母为检测人数(名)

表3 随访2年时(第五次随访)ELISPOT与TST检测结果在不同结核分枝杆菌暴露人群中的比较

注 表中括号内数值分子为阳性例数，分母为检测人数(名)

表4 密切接触者ELISPOT及TST检测结果与传染源痰AFB分级的关系

注 表中括号内数值分子为阳性例数，分母为检测人数(名)

除暴露时间和密切接触程度外，研究报道传染源痰结核分枝杆菌检测情况也是决定密切接触者暴露程度的重要因素[7]。为此，笔者进一步分析了密切接触者的传染源。痰涂片抗酸杆菌(AFB)分级的结果与ELISPOT和TST检测结果的关系(表4)。结果发现，传染源的AFB分级结果与密切接触者ELISPOT和TST检测的结果没有相关性。

讨 论

IGRAs和TST是当前用于LTBI诊断的两个主要手段，由于LTBI诊断缺乏金标准，有关两者在LTBI诊断中的优缺点一直存在争议，直至最近WHO和多个国家与地区根据做出了相应的应用指南[8-10]。但另一方面，由于LTBI者本身异质性明显， 包括了从稳定的LTBI到即将要发病的LTBI，因此，从LTBI中进一步筛查结核病发生高风险(即将要发病的LTBI)要远比笼统的诊断LTBI重要，也是当前结核病诊断最为严峻的挑战之一。本研究采用自制IGRAs试剂，通过对完成了2年5次随访的127名未发病的密切接触者与随访期间发现的11例新发活动性结核病患者进行IGRAs和TST平行检测分析，发现IGRAs较TST在密切接触者人群的随访中更有优势。理由是，11例新发患者与未发病的接触者比较，前者IGRAs阳性率显著增高，而TST阳性率则差异无统计学意义；再有，IGRAs检测阳性率与结核分枝杆菌暴露程度呈正相关，而TST检测结果与暴露无关，其结果与暴露程度相反。虽然，笔者尚不明确本项目中结核分枝杆菌暴露程度较高的密切接触者(家属)的TST检测阳性率反而低于接触程度较低的密切接触者(同事)的确切原因，但至少说明在密切接触者中筛选LTBI时，TST的检测效率有限。笔者此前的研究表明,TST检测阴性的成年人在BCG接种3个月后，TST检测结果96%(26/27)转为阳性，而ELISPOT检测的阳性率不受影响[3]。因此，上述TST检测结果与结核分枝杆菌暴露程度不一致，可能是由于TST不能有效区分BCG接种和LTBI所造成的。另外，由于TST检测无法区分结核分枝杆菌感染和非结核分枝杆菌感染[11]， 本项目入组人群年龄>14岁，环境中反复暴露的非结核分枝杆菌所诱导的免疫反应，可能是TST检测结果与暴露程度不一致，甚至相反的另一种可能原因。

尽管上述结果表明IGRAs较TST检测在密切接触者中筛查LTBI更有优势，但仅仅通过IGRAs检测，在11例新发活动性肺结核患者中ELISPOT检测阳性率只有72.7%。相反，虽然TST检测阳性率为63.6%；但联合ELISPOT检测的阳性率将达到90.9%，表明IGRAs联用TST有利于提高对密切接触者中高风险人群筛查诊断的敏感度，可以发现绝大部分(10/11)密切接触者中的LTBI患者。对1例IGRAs和TST检测均阴性的患者的临床资料进行核查，确认肺结核的诊断。该患者年龄为73岁，无合并其他疾病，外周血T淋巴细胞计数正常；因此，考虑是年龄大、免疫抑制导致的ELISPOT和TST检测结果阴性，但确切的原因尚需要进一步研究确定。另外，在随访中笔者发现11例新发活动性肺结核有5例在随访6个月发病，5例在随访1年时发病，1例在随访2年时发病，提示我们随访筛查高危人群，大部分活动性结核病患者的密切接触者发病时间发生在18个月内，这提示在日后对结核病患者的密切接触者随访时间至少要延长到18个月以上。

动物实验中，暴露的细菌浓度越高，感染的机会越多。流行病学结果是暴露于结核分枝杆菌载量越高的传染源的密切接触者，其发生感染的风险越高[6]。然而本研究的结果说明，无论是密切接触者的IGRAs还是TST检测阳性率均与传染源的AFB的等级没有相关性。这一结果提示，肺结核传染性的高低不能依靠痰涂片结果来确定，涂片阴性者仍然有传染性。但有必要指出，笔者选择138例完成了2年随访的密切接触者进行分析，不能代表所有的密切接触者的情况。另外，痰涂片AFB分级是一个粗略的定量手段，不够精确；也不能排除IGRAs和(或)TST检测敏感度有局限性的问题。

最后，有必要指出的是，本研究随访发现的11例新发肺结核患者中，有27.3% 为IGRAs检测阴性，有36.4% 为TST检测阴性。这一结果表明，无论是ELISPOT还是TST检测，其在密切接触者中筛查发现新发患者的敏感度均不足。因此，在临床实践中，尤其是在新的有效筛查检测方法面世之前，应该在做IGRAs检测的同时联合常规症状和胸部影像学检查结果加以综合考虑，以期提高早期发现的敏感度和准确率。

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(本文编辑：薛爱华)

Evaluation of interferon-gamma release assays and tuberculin skin test in screening active tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of pulmonary tuberculosis patients

LI Jin, YANG Qian-ting, YUE Jian-rong, LIN Ling, ZHANG Ming-xia, GU Mei-hong, DENG Qun-yi, DENG Guo-fang, DENG Yong-cong, CHEN Xin-chun.

Shenzhen Key Laboratory of Infection and Immunity, Guangdong Key Laboratory of Diagnosis and Treatment of Emerging Infectious Diseases, Guangdong Medical College, Shenzhen Third People’s Hospital, Shenzhen 518020,China

CHEN Xin-chun, Email: chenxinchun@hotmail.com

Objective To evaluate the efficiency of interferon release assays (IGRAs) and tuberculin skin test (TST) in screening active tuberculosis (TB) and latent tuberculosis infection (LTBI) in close contacts of pulmonary TB patients. Methods Samples of 138 close contacts of TB patients from family members (60 cases) and colleagues (78 cases) were collected. ELISPOT test (ELISPOT) and TST parallel detection were done every six months during the whole process of 24 months. Statistical analysis of the relationship between the results and disease occurrence andMycobacteriumtuberculosisexposure was performed. Results Among 138 close contacts who completed 5 times of follow-up detection in a period of 24-month, 11 cases developed to active PTB. Of the 11 patients, the positive rate of first ELISPOT was 72.7% (8/11), which was significantly higher than that of the unaffected (33.1%, 42/127)(χ2=6.8905,P=0.0087).While the positive rates of first TST were 63.6% (TB) and 66.9% (unaffected) respectively, and the difference was not statistically significant (χ2=0.0494,P=0.8241). ELISPOT positive rate was correlated to the degree of exposure toMycobacteriumtuberculosis.In high level exposure close contacts (families), ELISPOT positive rate was 45.0% (27/60), which was significantly higher than the low level exposure colleagues (28.2%, 22/78)(χ2=4.1773,P=0.0410). While TST positive rates among the high and low level exposure group were 55.0% (33/60) and 75.6% (59/78) respectively, which was inconsistent withMycobacteriumtuberculosisexposure level. Conclusion Compared to TST, IGRAs-ELISPOT has higher specificity in high risk population in close contacts of PTB cases, and is more accurate in the detection of active TB and LTBI in close contact of PTB patients.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Contact tracing； Interferon-gamma release tests； Tuberculin test; Enzyme-linked immunospot assay； Follow-up studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.007

“十二五”国家科技重大专项(2013ZX10003004-002-006)；广东省医学科研基金(B2014354)；深圳市科技计划项目(JCYJ20130329171031741)

5180202 广东医学院附属深圳市第三人民医院深圳市感染免疫重点实验室 广东省新发传染病诊治重点实验室(李晋、杨倩婷、林玲、张明霞、顾美红、陈心春)，内科(岳建荣、邓群益、邓国防、邓永聪)

陈心春，Email：chenxinchun@hotmail.com

2015-02-11)