结核感染T细胞斑点试验在临床诊断为肺外结核患者中的价值评价

孙雯雯 肖和平 吴福蓉 闫丽萍



·论著·

结核感染T细胞斑点试验在临床诊断为肺外结核患者中的价值评价

孙雯雯 肖和平 吴福蓉 闫丽萍

目的 探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测临床诊断为肺外结核患者中的价值，并且进行评价研究。方法 采用回顾性分析方法分析上海市肺科医院2011年1月至2013年12月收治的临床诊断为肺外结核并行抗结核治疗或诊断性抗结核治疗的患者731例。收集所有患者的T-SPOT.TB检测结果，用SPSS 16.0软件对结果进行统计学分析，观察组间样本率的比较采用χ2检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。结果 本研究中最终通过病理、细菌学及诊断性抗结核治疗共确诊肺外结核686例，其中T-SPOT.TB检测阳性者为656例，敏感度为95.63%(656/686)；本研究中最终排除肺外结核的患者共45例，其中T-SPOT.TB检测阴性者为37例，特异度为82.22%(37/45)；本研究中T-SPOT.TB检测阳性者共664例，阳性预测值为98.80%(656/664)；本研究中T-SPOT.TB检测阴性者共67例，故阴性预测值为55.22%(37/67)。对不同部位肺外结核T-SPOT.TB分层分析，发现不同部位肺外结核的T-SPOT.TB检测阳性率具有一定差异，其中淋巴结结核T-SPOT.TB 检测阳性率最高，达98.37%(181/184)。对于最终确诊肺外结核患者进行分组分析，初治组T-SPOT.TB检测阳性率为94.63%(476/503)，复治组为98.36%(180/183)，两者比较差异有统计学意义(χ2=6.41，P<0.05)；细菌学检查阳性组T-SPOT.TB检测阳性率为100.00%(32/32)，而细菌学、病理学检查均阴性组T-SPOT.TB检测阳性率为95.66%(551/576)，两者比较差异有统计学意义(χ2=4.14，P<0.05)。合并活动性肺结核组T-SPOT.TB 检测阳性率为95.45%(462/484)，不合并活动性肺结核组T-SPOT.TB检测阳性率为96.04%(194/202)，两者相比差异无统计学意义(χ2=0.11，P=0.74)。结论 T-SPOT.TB检测在临床诊断为肺外结核患者中具有较高的敏感度和特异度，阳性预测值也较高，但仍有一定的假阳性和假阴性；不同部位肺外结核T-SPOT.TB检测阳性率差异有统计学意义；细菌学阳性及复治肺外结核T-SPOT.TB检测阳性率可能更高。

结核/诊断； 酶联免疫斑点测定； 评价研究

我院近两年对收治的临床考虑肺外结核拟行抗结核治疗或诊断性抗结核治疗的患者大规模开展T-SPOT.TB检测，现对这些患者的T-SPOT.TB检测结果进行回顾性分析，以评价该技术在肺外结核早期诊断方面的临床价值。

资料和方法

一、临床资料

回顾性分析2011年1月至2013年12月3年内，上海市肺科医院结核科收治的临床诊断考虑为肺外结核、行抗结核治疗或者诊断性抗结核治疗的患者共731例，纳入患者均无严重的全身疾病或HIV感染。收集所有患者的T-SPOT.TB检测结果。

对于最终确诊为肺外结核的患者根据具体临床发病部位进行统计，并对相应T-SPOT.TB检测结果进行分层分析。

对于最终确诊为肺外结核的患者进行以下分组，分别对比T-SPOT.TB检测结果：初治组与复治组；细菌学阳性组和病理学阳性组为2个组与病理学、细菌学均阴性组此为1个组；合并活动性肺结核组与不合并活动性肺结核组。

二、T-SPOT.TB检测及质量控制

T-SPOT.TB检测试剂盒购自英国牛津Immunotec公司。采集患者外周静脉血4 ml，肝素抗凝，分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用细胞培养基AIM-V重悬细胞，并将细胞浓度调整至2.5×106个/ml。在已包被抗-γ干扰素(IFN-γ)单克隆抗体的96孔板上，分别单孔加入50 μl细胞培养基作为空白对照、50 μl植物血凝素作为阳性对照，以50 μl结核分枝杆菌ESAT-6和CFP-10作为刺激源，每个孔中加入100 μl上述细胞悬液，将96孔板置于37 ℃孵箱培养16～20 h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗板4次，加入碱性磷酸酶标记的二抗，在2～8 ℃下孵育1 h；孵育后再用PBS洗板4次；最后每孔加入显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐 (BCIP)+氯化硝基四氮唑蓝(NBT)，室温中静置7 min后去离子水终止反应。观察结果，用酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)计数仪进行斑点阅读与统计，当ESAT-6或CFP-10任一检测孔达到以下标准则判定为阳性:(1)如果空白对照孔斑点数<5个，检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数≥6；(2)如果空白对照孔斑点数≥6个，检测孔斑点数必须>2倍的空白对照孔斑点数。阴性结果判断：如果上述阳性标准不符合且阳性质量控制对照孔正常时，检测结果为“阴性”。所有T-SPOT.TB检测阴性患者均送检第二次复查，若第二次阳性计阳性结果，若第二次仍阴性计为阴性。

4.3 腹腔镜手术 近年来腹腔镜手术广泛用于妇科手术，腹腔镜手术有潜在的复发风险，如囊肿破裂，肿瘤细胞播散和切口部位转移，而标本袋的使用降低了术中肿瘤破裂及切口部位种植转移的风险。杨菁等[22]研究发现，腹腔镜手术与传统开腹手术有相似的疗效及安全性，但腹腔镜手术术中出血少、术后并发症少、住院时间短、恢复快，可减少盆腔粘连，更利于之后受孕。腹腔镜与开腹手术相比，囊肿破裂和不完全分期的发生率更高(33.9% vs. 12.4%)[23]。 因此，应该由经验丰富技术娴熟的妇科肿瘤专家对BOTs进行腹腔镜手术，以减少腹腔内肿瘤破裂和分期不全的风险，从而降低复发率。

三、统计学方法

应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计数资料用率或构成比表示，样本率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 临床资料

本研究共收集符合上述要求的患者731例，其中最终通过病理、细菌学及诊断性抗结核治疗共确诊肺外结核686例。男413例，女273例，年龄15～81岁，平均年龄(45.6±22.8)岁。其中通过病理确诊者78例，细菌学确诊者32例，诊断性抗结核治疗确诊者576例。在所有确诊为肺外结核的患者中，484例合并活动性肺结核，202例未合并活动性肺结核；119例为多个肺外器官结核，567例为单个肺外器官结核。在所有行诊断性抗结核治疗的患者中，有45例最终排除肺外结核；其中32例为恶性肿瘤(包括25例实体肿瘤和7例淋巴瘤)，7例为真菌感染，6例为感染性疾病(包括4例克罗恩病，2例病毒性脑膜炎)。

二、 T-SPOT.TB检测结果

731例入组患者中，最终确诊为肺外结核的患者有686例，T-SPOT.TB检测阳性者为656例，敏感度为95.63%(656/686)；本研究中最终排除肺外结核的患者共45例，其中T-SPOT.TB检测阴性者为37例，特异度为82.22%(37/45)；本研究中T-SPOT.TB检测阳性者共664例，故阳性预测值为98.80% (656/664)，本研究中T-SPOT.TB检测阴性者共67例，阴性预测值为55.22%(37/67)。

三、 所有肺外结核患者的临床分布及相应的T-SPOT.TB检测结果

在所有单个部位肺外结核中T-SPOT.TB阳性率最高者为淋巴结结核(98.37%)，其次是骨关节结核(97.56%)(表1)。

表1 不同部位肺外结核患者T-SPOT.TB检测结果

四、初治组、复治组T-SPOT.TB检测结果对比

最终确诊为肺外结核的686例患者中，503例为初治，其中476例T-SPOT.TB检测阳性，T-SPOT.TB检测阳性率为94.63%(476/503)；183例为复治，其中180例T-SPOT.TB检测阳性，T-SPOT.TB检测阳性率为98.36%(180/183)，两者阳性率比较，差异具有统计学意义(χ2=6.41，P<0.05)(表2)。

表2 初治、复治肺外结核患者T-SPOT.TB检测结果

五、病理学阳性组、细菌学阳性组与病理学、细菌学均阴性组T-SPOT.TB检测结果对比

在最终确诊肺外结核患者中，病理学确诊78例(其中T-SPOT.TB检测阳性75例)，细菌学阳性32例(其中T-SPOT.TB检测阳性32例)，病理学与细菌学均为阴性576例(其中T-SPOT.TB阳性551例)，3组T-SPOT.TB检测结果进行对比(表3)，发现细菌学阳性组与阴性组相比，差异有统计学意义(χ2=4.14，P<0.05)；病理学阳性组与阴性组对比，差异无统计学意义(χ2=0.01，P=0.93)；细菌学阳性组与病理学确诊组对比，差异无统计学意义(χ2=0.21，P=0.65)

表3 细菌学阳性组、病理学阳性组、细菌学与病理学均阴性组肺外结核患者T-SPOT.TB检测结果分析

六、合并活动性肺结核组与不合并活动性肺结核组T-SPOT.TB检测结果对比

在最终确诊肺外结核患者中，484例(484/686，70.55%)合并活动性肺结核，T-SPOT.TB检测阳性462例，T-SPOT.TB检测的敏感度为95.45%(462/484)；202例不合并活动性肺结核，T-SPOT.TB检测阳性194例，T-SPOT.TB检测的敏感度为96.04%(194/202)；两组T-SPOT.TB检测结果进行对比(表4)，差异无统计学意义(χ2=0.11，P=0.74)。

表4 合并与不合并活动性肺结核的肺外结核患者T-SPOT.TB检测结果分析

讨 论

一、肺外结核的诊断

结核病是由Mtb感染引起的一种慢性传染病，可侵及全身各系统及器官，肺外结核指发生于肺部以外脏器的结核病，其起病隐匿、常继发于隐性感染、可发生于人体几乎所有重要器官，对于感染结核的患者进行早期诊断是改善患者预后的关键，也是控制结核分枝杆菌播散的重要环节。众所周知，结核病诊断的金标准是以病变部位相应体液或者组织标本的细菌学或病理学为准，但肺外结核存在标本获取的困难，有些即使获取了标本，也遇到标本质量不确定、病理表现不典型、细菌学阳性率低的难题[1]，再加上肺外结核的临床表现因发生器官不同而多种多样，其早期症状往往不典型、同时非结核病专科医生对结核病的警惕性不高，患者往往辗转检查，耗时、耗力又耗财[2]。目前临床上大多数肺外结核(如骨关节结核、肠结核和盆腹腔结核等)常以影像学、PPD试验、结核抗体等检查结合临床症状及诊断性抗结核治疗而确诊，如诊断性治疗疗效欠佳有些甚至需要求助于外科手术获取标本。未经治疗的结核病存在着术后播散、伤口经久不愈的风险，因此临床上急需探索更多的检测手段来早期辅助诊断肺外结核，既减少患者痛苦，也为临床医生的诊断性治疗加一份筹码。

二、T-SPOT.TB在结核诊断方面的优势

传统的结核菌素试验(tuberculin skin test，TST)是多年来临床传统使用的快速早期筛查结核感染的免疫学方法，因所使用的结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)是多种抗原的混合物，受卡介苗(BCG)接种和非结核分枝杆菌感染的干扰，特异度较低；且受人类个体免疫力影响，在免疫低下人群中的敏感度大大降低，而结核病患者大多存在免疫功能受损[3]。因此，TST检测在我国的临床应用具有较大的局限性；临床常规检测的结核抗体试验所用的原理是以纯化结核分枝杆菌抗原来检测血清中相应的IgG抗体。IgG抗体常在发病的中晚期出现，故发病早期会导致检测结果的假阴性，同时抗体的产生和遗传背景也有相关性，结核病患者产生抗结核抗体的个体差异极大[4]，敏感度和特异度都较低，诊断价值亦十分有限。机体对结核分枝杆菌的免疫反应主要是由T淋巴细胞发动的细胞免疫，机体被结核分枝杆菌感染后体内T淋巴细胞被致敏，当这些致敏T细胞再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后，就会产生细胞因子IFN-γ，T-SPOT.TB检测是利用ELISOPT检测分泌IFN-γ的结核特异性T淋巴细胞水平的实验方法。其采用的抗原ESAT-6与CFP-10为结核分枝杆菌特异性抗原，不存在于卡介苗及绝大多数环境分枝杆菌中，从而保证了其诊断结核分枝杆菌感染的特异度。我国是结核病高发的发展中国家，又是BCG广泛接种地区。因此，T-SPOT.TB检测在我国结核病诊断中的意义非凡，特别是不易获取细菌学或者病理学标本的肺外结核；该技术操作过程简单、快速，24 h可获取结果。研究显示，T-SPOT.TB 检测结果受人体免疫功能(T淋巴细胞)影响较传统的TST及结核抗体小[5]；而从肺外结核的发生机制来说，与肺结核患者相比，肺外结核患者更可能存在免疫功能低下。在这种情况下，TST和结核抗体出现阴性(无反应)的可能性很大，T-SPOT.TB检测技术的出现可能为这部分免疫功能低下的患者给予明确诊断带来了帮助。近年来，T-SPOT.TB检测技术已在国内外广泛应用于临床结核病的早期诊断，但大规模的临床报道罕见。Fan等[6]的Meta分析显示，T-SPOT.TB检测技术诊断肺外结核的总敏感度和特异度分别为90%和68%；Liao等[7]报道，T-SPOT.TB检测诊断肺外结核的敏感度和特异度分别为79.8%和81.6%；Kim等[8]对72例怀疑肺外结核患者的前瞻性研究显示，T-SPOT．TB与PPD诊断活动性肺外结核的敏感度分别为94%和47%；李明武等[9]对78例肺外结核患者的T-SPOT.TB检测结果进行分析，发现T-SPOT.TB检测诊断活动性肺外结核的敏感度为89.7%、特异度为95.4%。本研究入选患者731例，是目前文献可查T-SPOT.TB检测诊断肺外结核入选患者最多的研究，笔者认为具有较大的意义。本研究发现T-SPOT.TB检测在疑似肺外结核人群中具有较高的敏感度(95.63%)和特异度(82.22%),与现有的国内外研究结果相比，敏感度相似，但特异度似乎更高。笔者认为，由于我国是结核病高流行国家，与发达国家相比，在流行病学上存在较大差异；且本研究入选患者皆为临床诊断为肺外结核的患者，因此特异度较高；但这并不能代表T-SPOT.TB检测在健康人群中的特异度，而目前大多数关于T-SPOT.TB检测的特异度研究均在结核病低流行地区。

三、不同部位、不同类型肺外结核T-SPOT.TB检测的差异

根据临床表现不同，肺外结核可分为两大类，一为急性起病全身播散的结核，如血行播散型结核、中枢神经系统结核等；二为隐匿起病、慢性发展的局部肺外结核，如淋巴结结核、骨关节结核等，这两大类肺外结核临床上的差异，可能导致造成机体分泌IFN-γ的结核特异性T淋巴细胞水平的不同，从而造成在不同部位肺外结核中T-SPOT.TB检测敏感度的差异[8]。Cho等[10]对368例疑似肺外结核患者进行研究，发现在T-SPOT.TB检测淋巴结结核和骨关节结核中敏感度高达95%，而在结核性脑膜炎中仅为79%。这与本研究中T-SPOT.TB检测在淋巴结结核(98.37%)和骨关节结核(97.56%)中敏感度最高一致；但本研究中T-SPOT.TB在结核性脑膜炎中的敏感度(93.48%)并不低，这可能与部分患者存在既往结核病病史有关。本研究中T-SPOT.TB在183例复治肺外结核中的敏感度高达98.36%，较初治肺外结核94.63%的敏感度高，且差异具有统计学意义(χ2=6.41，P<0.05)；这提示结核分枝杆菌二次感染或者复燃都可能刺激机体分泌IFN-γ的结核特异性T淋巴细胞水平的波动。本研究中，笔者将细菌学阳性组、病理学阳性组和两者皆阴性患者的T-SPOT．TB检测结果进行对比，发现细菌学阳性者T-SPOT．TB检测的阳性率显著高于阴性组(χ2=4.14，P<0.05)，已有同类实验证实血清学诊断在肺结核涂阳组的敏感度高于涂阴组，提示涂阳肺结核患者体内含有较多结核分枝杆菌，使免疫系统更易受到结核分枝杆菌抗原的刺激，引起较强的免疫应答，产生更多的特异性抗体[11]，从而导致T细胞免疫应答增强；但本研究中病理学确诊患者T-SPOT．TB阳性率与阴性率组差异无统计学意义，是否真的差异无统计学意义、无统计学意义的原因是什么，是否可能有类似的机制影响病理确诊患者T-SPOT．TB检测结果，仍需进行深入的研究。本研究确诊肺外结核患者中有484例合并活动性肺结核，202例未合并活动性肺结核，对两组T-SPOT．TB检测结果进行对比，差异无统计学意义(χ2=0.11，P=0.74)。这个结果带给我们两个信息：(1)临床上大多数肺外结核是合并活动性肺结核存在的(484/686,70.55%)。(2)是否合并活动性肺结核，似乎对T-SPOT．TB检测的结果影响不大。肺外结核既可以单独存在或与肺结核共存，大多数肺外结核来源于肺结核[12]。因此这部分(肺结核合并肺外结核)患者应该是我们需要研究的重点；但应该引起重视的是，当肺外结核单独存在时，带来的是更大的诊断上的难度，很多需要通过外科手术否则难以获取足够的标本进行细菌学和病理学检测，这又给我们带来了诊断上的难点。从本研究的结果推测，对于肺外结核而言，是否合并肺结核并未显著影响T-SPOT．TB的检测结果，提示T-SPOT．TB 对于不易获取细菌学或者病理学标本的肺外结核可能具有较大的意义。

四、关于T-SPOT.TB 检测结果假阳性与假阴性的讨论

本研究中，出现8例假阳性结果，笔者认为这可能与以下因素有关：(1)IGRA在发达国家主要用于潜伏性结核感染的诊断和预防性治疗，但我国是结核病高流行国家，结核感染率高达44.5%，因此用于结核病诊断时，可能出现假阳性率较高的现象。(2)在8例假阳性患者中，3例有既往结核病史。这提示临床医生，T-SPOT.TB 检测可能无法有效区分活动性结核病和既往结核感染，这与部分研究表明T-SPOT．TB检测在鉴别活动性结核病与潜伏性结核感染和既往陈旧性结核方面作用有限[13]这一结果相符。我国是结核病高流行地区，较高的潜伏性结核感染率可能降低外周血T-SPOT．TB协助诊断活动性结核病的临床应用价值。因此，临床医生仍需结合患者临床及其他实验室指标综合考虑，切不可盲目依赖。本研究中出现了30例假阴性结果，且所有阴性结果均为2次检测结果，有效排除了人为实验误差。国内外的文献及研究已证明，一般的免疫力低下及使用免疫制剂不影响T-SPOT.TB检测的阳性结果；国内有学者对T-SPOT.TB检测诊断假阴性者分别进行了相关危险因素分析,发现年龄、糖皮质激素或免疫抑制剂的使用、淋巴细胞减少症和低白蛋白血症均不是T-SPOT.TB检测诊断假阴性的危险因素[14]。但在本研究中，仍有30例确诊为肺外结核患者的T-SPOT.TB检测为阴性。笔者认为虽然同前所述国内外研究表明T-SPOT.TB受人体免疫功能影响较小，但也有研究证明T-SPOT.TB检测在免疫功能低下的结核病患者中敏感度较免疫正常的患者降低，且差异具有统计学意义[10]。国外学者研究发现HIV患者CD4细胞绝对值下降的情况下T-SPOT.TB检测的敏感度降低[15]，但目前尚无肯定的大规模数据来验证T-SPOT.TB与人体免疫功能的相关性，以及淋巴细胞影响T-SPOT.TB 检测结果的界值，这是需要临床上深入进行纵向研究的方面。由于本研究中，假阴性例数比例少，不能妄下定论。笔者认为针对这一问题有必要扩大样本做进一步分析研究，因为T-SPOT.TB检测阴性的肺外结核进行进一步的外科活检在所难免，不但加重患者经济负担还可能延误治疗、增加患者痛苦、增加外科医生手术风险，临床医生有必要对这一问题展开研究。在本研究中假阳性例数远远少于假阴性例数(阳性预测值大于阴性预测值)，这提示我们，在肺外结核高风险人群中，T-SPOT．TB检测存在一定的假阴性率，假阴性的原因有待进一步考证；但临床遇到T-SPOT．TB阴性但又高度怀疑肺外结核的患者，必须进行密切随访，以减少漏诊。

综上所述，T-SPOT.TB检测在临床诊断为肺外结核的人群中，具有较高的敏感度、特异度和阳性预测值，临床医生可以参考其结果并结合其他临床资料进行下一步治疗，但切不可盲目依赖，因为仍存在一定的假阴性率。笔者认为，T-SPOT.TB检测在临床虽然开展多年，已经不算是一个新技术，但其应用前景良好，有进行深入、纵向研究的必要，特别是对于T-SPOT.TB检测产生假阴性和假阳性结果的原因进行相关性分析，以期更好地将这一技术应用于临床，并进一步推广至非结核病专科医院，提高肺外结核的早期检出率。

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(本文编辑：范永德)

Clinical evaluation of T-SPOT.TB test in patients clinical diagnosed extrapulmonary tuberculosis：a clinical review

SUN Wen-wen，XIAO He-ping，WU Fu-rong，YAN Li-pin.

Tuberculosis Clinical Care Centre，Shanghai Pulmonary Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis,Shanghai 200433，China

XIAO He-ping，Email：xiaoheping_sars@163.com

Objective To study the clinical evaluation of T-SPOT.TB test in patients clinical diagnosed extrapulmonary tuberculosis. Methods We retrospectively analyzed the T-SPOT.TB results of 731 patients who were clinical diagnosed extrapulmonary tuberculosis from 2011.1-2013.12 in Shanghai pulmonary hospital. The results of T-SPOT.TB in all patients were collected and statistical analysis was done by SPSS 16.0. Comparison the difference between two groups using Chi-squared test.P<0.05 was considered statistically significant. Results We finally confirmed 686 cases of extrapulmonary tuberculosis through pathology、bacteriology and diagnostic treatment，656 of them were T-SPOT.TB positive，the sensibility is 95.63% (656/686)；45 cases were finally excluded the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis，37 of them were T-SPOT.TB negative，the specificity is 82.22% (37/45)；of all the 731cases，T-SPOT.TB was positive in 664 cases，the positive predictive value is 98.80% (656/664)；T-SPOT.TB was negative in 67 cases，the negative predictive value is 55.22% (37/67). Stratification analysis showed that the positive rate of T-SPOT.TB in different locations of extrapulmonary tuberculosis were different.Tuberculous lymphadenitis had the highest positive rate (98.37%，181/184). The positive rate of T-SPOT.TB in re-treatment patients (98.36%,180/183) was significant higher than that in initial treatment patients (94.63%，476/503)(χ2=6.41，P<0.05). The positive rate of T-SPOT.TB in patients who were bacteriogically positive (100%) was significant higher than those were negative both pathologically and bacteriologically (95.66%，551/576)(χ2=4.14，P<0.05). The positive rate of T-SPOT.TB in patients wheher combined with active pulmonary (95.45%，462/484) or not (96.04%，194/202) was no significant difference (χ2=0.11，P=0.74). Conclusion T-SPOT.TB has a high sensibility、specificity and positive predictive value in patients who were clinical diagnosed extrapulmonary tuberculosis，but there still could be false positive and false negative.The positive rate of T-SPOT.TB in different locations of extrapulmonary tuberculosis seemed to be different. Patients who were bacteriogically positive or re-treatment seemed to have higher positive rates of T-SPOT.TB.

Tuberculosis/diagnosis； Enzyme-linked immunospot assay； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.014

200433同济大学附属上海市肺科医院结核病临床研究中心 上海市结核病(肺)重点实验室

肖和平；Email：xiaoheping_sars@163.com

2014-12-01)