甘草对液体发酵中槐耳菌丝体生长及多糖影响初探*

冯 杉，李赛楠，江林芡，常艳旭，马 琳

（天津中医药大学，天津 300193）

甘草对液体发酵中槐耳菌丝体生长及多糖影响初探*

冯 杉，李赛楠，江林芡，常艳旭，马 琳

（天津中医药大学，天津 300193）

[目的]以槐耳菌丝体生物量及多糖为主要指标,探究槐耳-甘草液体共发酵中最佳甘草的添加量和发酵时长。[方法]采用液体发酵技术，在液体发酵培养基中加入甘草提取液，共发酵获得槐耳-甘草共发酵产物，苯酚-硫酸法及DNS法结合测定多糖含量。[结果]槐耳-甘草液体共发酵实验中，添加甘草8 g/L、发酵终点设为192 h时，槐耳生物量和胞内多糖产量达到最大值。[结论]运用槐耳-甘草液体共发酵可以提高槐耳生物量及多糖的含量，为深入研究槐耳-甘草液体共发酵机制提供了理论依据。

槐耳；液体发酵；多糖

槐耳，又名槐栓菌（Trametes robiniophila Murr.），为非褶菌目、多孔菌科、栓菌属真菌子实体[1]，是中国民间重要的药用真菌之一。它在治疗和辅助治疗肿瘤方面有十分显著的疗效[2-6]，主要生理活性物质为槐耳多糖[7-8]。研究发现利用发酵技术获得槐耳菌丝体具有与槐耳子实体相同功效[9-10]，因此，采用槐耳液体发酵提高槐耳多糖的产量、代替子实体应用于医药产业成为可能。甘草（Glycyrrhizae Radix）为豆科植物甘草的干燥根及根茎，具有抗炎、抗癌、保肝等功效[11-12]。利用槐耳生长过程中的分解合成代谢作用，使甘草原有活性成分转化，合成自身活性物质，有可能产生新成分和新功能[13-14]，并增强槐耳的特殊疗效。本实验初步探讨甘草对槐耳发酵过程中菌丝体生长和多糖产量的影响，为中药转化槐耳的新型发酵研究提供借鉴。

1 仪器与材料

1.1 供试菌种及药材 槐栓菌（Trametes robiniophilaMurr.）菌种，由南京中医药大学庄毅教授提供。甘草（Glycyrrhizae Radix），购置于北京同仁堂药店。

1.2 实验试剂 葡萄糖（AR，天津市北方天医化学试剂厂），苯酚（AR，天津市光复精细化工研究所），浓硫酸（AR，天津市化学试剂供销公司），3，5－二硝基水杨酸（AR，天津市光复精细化工研究所），蛋白胨（BR，北京奥博星生物技术有限责任公司），琼脂粉（BR，天津市英博生化试剂有限公司）。

1.3 实验仪器 立式压力蒸汽灭菌器（YXQ－LS－50SII，上海博迅实业有限公司医疗设备厂），洁净工作台（JB－CJ－2FXS，苏州佳宝净化工程设备有限公司），立式摇床（SYC－C，上海联环生物工程设备有限公司），pH计（pHS－25，上海雷磁仪器厂），低速离心机（LD5－2A，北京京立离心机有限公司），双光束紫外可见分光光度计（TU－1901，北京普析通用仪器有限公司）。

1.4 培养基配方综合PDA培养基[15]（马铃薯葡萄糖琼脂培养基，g/L）：马铃薯 200、葡萄糖 20、琼脂15、磷酸二氢钾（KH2PO4）3.0、硫酸镁（MgSO4）1.5、VB10.006，pH自然。液体菌种培养基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨 3.0、KH2PO43.0、MgSO41.5、VB10.008，pH自然。

液体发酵培养基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨4.0、KH2PO43.0、MgSO41.5，VB10.008、甘草提取液适量，pH自然。

2 方法与结果

2.1 槐耳液体菌种的制备 取活化[16]好的槐耳母种，无菌条件下切割成0.5 cm2大小菌块，接种于液体菌种培养基中，放置于旋转式摇床中，转速150 r/min，27℃暗培养5 d，连续传代2次至菌液清亮，菌球细小稠密、大小均匀，备用。

2.2 甘草的预处理 甘草饮片粉碎，过60目筛。取甘草粉末30.00 g，按1∶8加水浸泡1 h，微沸状态提取30min，重复提取3次，提取液过滤。合并3次提取液并浓缩至一定体积，备用。

2.3 甘草添加量对槐耳生物量的影响 在液体发酵培养基中添加不同量的甘草水提液，作为药性培养基，以不添加甘草水提液为空白对照培养基。每组设3个重复，接种，于27℃摇床中暗培养6 d。发酵结束后，将发酵液离心，沉淀用蒸馏水冲洗3次，于60℃烘箱中烘干至恒重。结果显示当甘草添加量为8 g/L时，槐耳菌丝体生物量最大。槐耳菌丝体生物量变化见图1。

图1 甘草添加量对槐耳生物量的影响Fig.1 Effectsof Radix G lycyrrhizae contentson biomassof Trametes robiniophila

2.4 甘草槐耳共发酵生物量随发酵时长的变化 以添加8 g/L甘草的液体发酵培养基作药性培养基，不添加甘草为空白对照，接种并培养。每48 h取样1次，测定菌丝体干湿重，结果见图2。在槐耳液体发酵初期，0～48 h时间段内甘草组与空白组的生物量相差不大。发酵进行48 h，槐耳菌丝体生长速率显著增加，自此，甘草组槐耳菌丝体生物量一直明显高于空白组；并且甘草组槐耳菌丝体生物量在发酵进行192 h达到最高值，相比空白组延迟48 h，此时生物量接近空白组槐耳菌丝体生物量的2倍。

2.5 甘草对槐耳发酵产生多糖的影响

2.5.1 苯酚-硫酸法测定多糖含量 以无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法[17-19]测定多糖含量。精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品10.00mg，加水溶解并定溶于100mL容量瓶中，摇匀，制成每1mL含0.1mg的葡萄糖标准品溶液，备用。精密吸取葡萄糖标准品溶液一定体积于10mL具塞试管中，摇匀，再加水至2.0mL，另取2mL蒸

图2 槐耳发酵过程中干湿重的变化Fig.2 Changesof dry and wetweight in Trametes robiniophila fermentation

馏水为空白对照，依次加入1.0mL 5%的苯酚溶液，摇匀，迅速滴加浓硫酸各5mL，摇匀放置5min，置沸水浴中加热15min，再冰水冷却至室温，紫外分光光度法测定标准品溶液在最大吸收波长处的吸光度。

2.5.2 线性关系考察 依次精密吸取葡萄糖标准品溶液表1中体积，按照2.5.1中步骤测定吸光度，以吸光度为A纵坐标，浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程=60.224X+0.026 1（r＝0.999 4），线性范围为 2.5～20.0mg/L。

表1 葡萄糖标准溶液的吸取体积和吸光度Tab.1 Volume and absorption ofglucose standard solution

2.5.3 精密度实验 精密量取样品溶液2.0mL，按照2.5.1项下方法操作，连续重复6次测定吸光度，RSD（n＝6）为 0.07%，说明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性实验 精密量取样品溶液2.0mL，按照 2.5.1 项下方法操作，分别在 0、15、30、45、60、75min测定吸光度，显色在 75min 内较稳定，RSD（n＝6）为0.40%。

2.5.5 重复性实验 同批样品重复测定6次，RSD（n＝6）为1.67%，说明方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率实验 精密吸取总糖含量为25.8μg的样品溶液9份，分别精密加入相当于样品溶液中总糖含量的80%、100%、120%的葡萄糖标准品，制成高、中、低3个浓度组，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，按2.5.1项下方法操作，平均加样回收率为108.97%，RSD（n=9）为3.03%。

2.5.7 多糖测定 按照2.3和2.4项条件培养获得不同发酵工艺的干燥菌丝体。研细后加入20倍体积蒸馏水超声提取1 h，离心，收集上清液。以苯酚-硫酸法测定槐耳-甘草液体共发酵胞内多糖含量。添加8 g/L甘草，槐耳产生多糖量最多；且发酵终点较未添加甘草的空白组延后96 h。结果见图3、图4。

图3 甘草添加量对槐耳多糖的影响Fig.3 Effectsof Radix G lycyrrhizae contentson polysaccharideof Trametes robiniophila

图4槐耳发酵过程中多糖含量的变化Fig.4 Changesof polysaccharide contents in Trametes robiniophila fermentation

3 讨论与结论

甘草对槐耳菌丝体发酵具有显著影响，能促进菌丝体的生长和胞内多糖的生成。随甘草添加量的增加，槐耳菌丝体生物量与胞内多糖含量也相应呈增加的趋势；但当甘草添加量大于8 g/L，槐耳生物量和胞内多糖含量开始下降。因此，实验选择8 g/L的甘草添加量进行后续研究。

槐耳菌丝体生长大致经历3个阶段：适应期、快速生长期、稳定期，呈现“S”型生长趋势。发酵初期，槐耳处于适应期，菌丝体的生长和代谢不旺盛，生物量增长较缓慢。随后槐耳进入快速生长期，此时槐耳适应了培养条件，菌丝体生长加速。甘草对槐耳菌丝体生长具有较大的促进作用，并能延长槐耳快速生长期，从而使得槐耳-甘草共发酵时，菌丝体生物量以及多糖产量显著增加。生物量达峰值以后，随着培养基中酸度的增加、营养成分的缺乏及平均生存空间的减小，菌丝体出现衰亡、自溶现象，生物量开始下降，槐耳进入衰亡期。槐耳-甘草共发酵发酵192 h进入衰亡期，此时槐耳菌丝体生物量和多糖产量开始有所下降，因此，以192 h作为槐耳-甘草共发酵的发酵终点较为合理。

本实验采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，此方法简便、快速、准确、稳定，适用于杂质种类少、含量低等情况下多糖的测定。一般多糖的测定采用比色法，主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，其原理为多糖水解生成的单糖可与强酸产生糠醛或糠醛衍生物，通过显色剂所合成有色的络合物比色定量。有研究表明，蒽酮-硫酸法稳定性低于苯酚-硫酸法[20]。若要排除还原型杂质的干扰，还可结合3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定还原糖含量。此外，还有学者利用高效液相色谱法[21]、气相色谱法等测定多糖含量，方法更加快速、准确，并且能有效的避免传统方法因多糖水解不完全而产生的误差。

上述研究表明，液体培养基中甘草水提液添加量在8 g/L左右时对槐耳生物量和胞内多糖产量具有显著的促进作用，槐耳-甘草共发酵培养的最佳发酵时长为192 h。槐耳-甘草液体共发酵可以提高槐耳生物量及多糖的含量，但甘草对槐耳发酵的作用机制尚不明确，这些工作有待进一步的深入研究探讨。

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Prelim inary study on the impactof Glycyrrhizae Radix on the growth of Trametes robiniophila mycelium and

polysaccharide in liquid fermentation FENGShan,LISai-nan,JIANG Lin-qian,CHANGYan-xu,MA Lin
（Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To explore the bestaddition amount of Glycyrrhizae Radix and fermentation time of the liquid fermentation ofTrametes robiniophila-Glycyrrhizae Radix,withmycelialbiomassand fungipolysaccharide as themain indicators.[Methods]MycelialofTrametes robiniophilawas obtained in liquid fermentation,with Glycyrrhizae Radix added to liquid fermentationmedium.The contentof polysaccharideswas determined by phenol-sulfuric acid method and DNSmethod.[Results]The bestaddition amountof Glycyrrhizae Radixwas8 g/L and the best fermentation timewas192 hwhen the biomassand polysaccharide ofTrametes robiniophilagot to themaximum.[Conclusion]UsingTrametes robiniophila-Glycyrrhizae Radix liquid fermentation could increase themycelial biomass and the contentof intracellular and extracellular polysaccharides ofTrametes robiniophila.It provides a theoreticalbasis for improving the yield of liquid fermentation.

Trametes robiniophila;liquid fermentation;polysaccharide

R282.71

A

1672-1519（2015）09-0563-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.09.14

国家科技基础性工作项目（2007FY110600）；国家自然科学基金项目资助（810001632）；国家自然基金面上项目资助（81374050）。

冯 杉（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向为中药生物工程。

马 琳，E-mail:malin7983@163.com。

2015-03-29）

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