茸菖胶囊对幼年大鼠癫痫后NRSF和BDNF蛋白表达的影响*

杨常泉，王 伟，马 融

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

茸菖胶囊对幼年大鼠癫痫后NRSF和BDNF蛋白表达的影响*

杨常泉，王 伟，马 融

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

[目的]研究茸菖胶囊对幼年大鼠癫痫后神经元限制性沉默因子（NRSF）和脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白表达的影响。[方法]建立戊四唑点燃癫痫模型，分为中药高、中、低剂量组、西药组、模型组和空白组，用蛋白免疫印迹杂交法检测各组NRSF和BDNF蛋白的变化。[结果]幼年大鼠致痫后模型组海马NRSF和BDNF蛋白表达升高，中药高剂量组可显著降低大鼠海马齿状回NRSF和BDNF蛋白表达（P＜0.01），作用优于西药组和其他中药组。[结论]中药复方茸菖胶囊抗癫痫及改善癫痫后认知障碍机制可能与调控组蛋白乙酰化修饰及其所介导的神经元基因表达有关。

癫痫；海马；茸菖胶囊；脑源性神经营养因子；神经元限制性沉默因子

组蛋白乙酰化参与了癫痫发作及癫痫后认知功能的下降。神经元限制性沉默因子（NRSF）与组蛋白乙酰化密切相关，脑源性神经营养因子（BDNF）有与NRSF结合的神经限制性沉默元件（NRSE），其转录调控与组蛋白乙酰化密切相关[1-2]。本研究采用出生后16 d（P16）的SD大鼠建立戊四唑点燃癫痫模型及茸菖胶囊的干预作用下，应用蛋白免疫印迹杂交法检测NRSF、BDNF蛋白在大鼠海马区表达变化，探讨中药复方茸菖胶囊改善癫痫后认知障碍的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品 16日龄Sprague-Dawley大鼠（P16）48 只，清洁级，体质量（50±10）g，雌雄各半，由军事医学科学院实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK（军）2007-005）。茸菖胶囊由天津市石天药业公司提供（批件号：津药制字Z20070735号），规格：每粒0.33 g，50粒/瓶。丙戊酸钠口服溶液由赛诺菲安万特制药有限公司提供（国药准字H20041435），规格 300mL∶12 g。戊四唑由 Simga 公司提供（批号：P6500）。

1.2 模型制备与评价 采用戊四唑慢性点燃癫痫动物模型，参考王丽等[3]方法并加以改进。从大鼠出生后17～45 d（P17～P45）开始，用戊四唑亚惊厥剂量37mg/kg腹腔注射，每日1次，连续28 d。停药1周后（P52）再以相同剂量戊四唑腹腔注射，采用Racine评分法[4]凡显示连续连续5次Ⅱ级及以上惊厥的大鼠，被认为达到点燃标准。将出线Ⅳ级以上惊厥大鼠继续进行Morris水迷宫实验[5]筛选认知障碍模型大鼠。

1.3 分组与处理 共设6组，包括：空白对照组、癫痫模型组、中药治疗组（茸菖胶囊低、中、高3个剂量组，剂量 1∶2∶4）；西药对照组。各组给药剂量按人与大鼠体表面积换算公式计算。1）空白对照组：不作处理。2）癫痫模型组：灌服生理盐水10mL/kg，每日两次，持续28 d。3）中药治疗组：将茸菖胶囊按生药含量7.68、3.84、1.92 kg/L分别配制成相应浓度的药液，3组均按10 mL/kg灌药，每日2次，持续28 d。4）西药对照组：丙戊酸钠400mg/kg给药，每日2次，持续28 d。

1.4 标本采集 各组大鼠出现惊厥发作后1 h，断头剥离海马组织，转至EP管，液氮固定，-80℃低温保存。

1.5 蛋白免疫印迹检测 采用蛋白提取试剂盒加入磷酸酶抑制剂提取细胞总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳，半干法转膜，封闭，一抗孵育，洗膜，加入HRP标记的二抗孵育，ECL反应、胶片曝光。加入HRP标记的GAPDH抗体同时检测GAPDH含量。

1.6 统计学分析 应用SPSS18.0软件包进行统计学处理，全部实验数据用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组动物惊厥行为观察 在腹腔注射亚惊厥剂量戊四唑7 d逐渐有兴奋性增高的表现，如笼内跑跳明显增加，注射第10天起陆续出现如眨眼、动须、点头、头部抽搐等程度不等的惊厥发作，注射20 d以后呈逐渐加重趋势，尤其是注射30min后惊厥表现明显，出现前肢抬起，全身痉挛抖动等，精神狂躁不安，在饲养笼内上下翻跳及狂奔伴有嘶叫,失去体位控制。而对照组大鼠无痫样发作。

2.2 茸菖胶囊对海马组织NRSF蛋白表达的影响 癫痫模型组大鼠海马组织NRSF蛋白相对表达显著高于其他各组（P＜0.01）；中药高剂量组大鼠海马齿状回NRSF蛋白表达显著低于中药中剂量组、中药低剂量组及西药组（P＜0.01），西药组大鼠海马齿状回NRSF蛋白表达显著低于中药中剂量组及中药低剂量组（P＜0.01），而显著高于中药高剂量组（P＜0.01）。见表 1。

表1 各组大鼠海马组织NRSF蛋白表达的比较（±s）Tab.1 Expression of NRSF protein in hippocampus of rats in each group（±s）

表1 各组大鼠海马组织NRSF蛋白表达的比较（±s）Tab.1 Expression of NRSF protein in hippocampus of rats in each group（±s）

注：与空白对照组比较*P＜0.01；与癫痫模型组比较#P＜0.01，与西药对照组比较△P<0.05。

组别 动物数 NRSF空白对照组 8 0.57±0.06癫痫模型组 7 1.41±0.06*西药对照组 7 1.12±0.06*#中药高剂量组 8 0.90±0.04*#△中药中剂量组 8 1.22±0.04*中药低剂量组 8 1.30±0.047*

2.3 茸菖胶囊对海马BDNF蛋白表达的影响 其他各组大鼠海马组织BDNF蛋白表达显著高于空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。除中药中、低剂量组外，其他各组大鼠海马组织BDNF蛋白表达与癫痫模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。与西药对照组比较，中药高剂量组大鼠海马齿状回BDNF蛋白表达无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组海马BDNF蛋白表达的比较（±s）Tab.2 Expression of BDNF protein in hippocampus in each group（±s）

表2 各组海马BDNF蛋白表达的比较（±s）Tab.2 Expression of BDNF protein in hippocampus in each group（±s）

注：与空白对照组比较*P＜0.01；与癫痫模型组比较#P＜0.01，与西药对照组比较△P<0.05。

组别 动物数 NRSF空白对照组 8 0.52±0.10癫痫模型组 7 0.95±0.34*西药对照组 7 0.73±0.11*#中药高剂量组 8 0.70±0.18*#中药中剂量组 8 0.80±0.04*#△中药低剂量组 8 0.87±0.26*△

3 讨论

组蛋白的乙酰化是一个与基因转录活性高低密切相关的动态过程，组蛋白乙酰化水平及其调控致痫相关基因的表达是癫痫发作及癫痫后认知功能下降的重要调节机制之一[6-7]。NRSF与组蛋白乙酰化密切相关，在神经系统发生和癫痫发病中起着十分重要的作用。NRSF招募共阻遏子Sin3A及CoREST，后两者再招募HDACs到核小体附近，引发组蛋白低乙酰化状态，进而抑制了转录。Ballas等[8]报道NRSF及其所介导的基因表达参与了癫痫发生及癫痫后认知功能的下降。BDNF与癫痫后认知功能的下降密切相关。BDNF基因有与NRSF结合的NRSE，其转录调控与组蛋白乙酰化密切相关。痫性发作激发BDNF的转录上调，促进了海马苔藓纤维出芽及突触重组[9-10]。

抗癫痫药丙戊酸（VPA）已被证实是HDACs抑制剂，其可以增加了小鼠海马区H3的乙酰化，选择性激活了神经元BDNF启动子，抑制癫痫齿状回的NRSF表达，使NRSF依赖基因表达正常化，阻止癫痫发作引起的神经发生，减少认知功能障碍[11]。

马融教授认为小儿癫痫伴认知障碍的病机关键在于“肾精亏虚、风痰闭阻”，治疗上以“益肾填精、豁痰熄风”立法，前期临床研究表明茸菖胶囊不仅可以有效减轻癫痫的造成的认知障碍，而且可以有效控制癫痫的发作[12]。本实验研究结果发现幼年大鼠致痫后模型组海马NRSF和BDNF蛋白表达升高，中药高剂量组可显著降低大鼠海马齿状回NRSF和 BDNF蛋白表达（P＜0.01），作用优于西药对照组和其他中药组。提示癫痫后神经发生与组蛋白乙酰化修饰密切相关，中药填精充髓、豁痰熄风法复方茸菖胶囊通过调控组蛋白乙酰化水平调控神经发生进而改善癫痫大鼠认知障碍可能是其抗痫增智作用的多靶点机制之一。

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Effectof Rongchang capsuleson expressionsof NRSF and BDNF in hippocam pusof epilepsy rats

YANGChang-quan,WANGWei,MARong
（The FirstAffilited Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]Toexplore theeffectofRongchang capsules(RCC)on the protein expression ofneuronal restricted silencing factor(NRSF)and brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in hippocampusafter pentylenetetrazole(PTZ)induced epileptic seizure in young rats.[Methods]Toestablish the PTZkindlingmodelofepilepsy,the ratswere randomly divided into normalgroup,modelgroup,valproic acid sodium(VPA)group and RCC low,middle,high dosage group.The expression ofNRSF protein and BDNF proteinwere detected by theWestern blot hybridization assay.[Results]The expression of NRSF protein and BDNF protein in hippocampus of rats inmodel groupswere significantly higher than those in the blank group,and the differencewas statistically significant(P<0.05).Each treatgroup could reduce the expression,butRCC high dose group was better than VPA and RCC low,middle dosage group(P<0.05).[Conclusion]Themechanism of RCC antiepilepsy and improvement cognitive impairmentafter epilepsymay be related to the inhibition of NRSF and BDNFprotein expression in juvenile rathippocampusafterepilepsy.

epilepsy;hippocampus;Rongchang capsule;brain derived neurotrophic factor;neuronal restricted silencing factor

R742.1

A

1672-1519（2015）09-0555-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.09.12

国家自然科学基金面上项目（81173301，30973772）；国家自然基金青年科学基金项目（81001539）；天津市应用基础及前沿技术研究计划（10JCZDJC20600，11JCYBJC12300）。

杨常泉（1975-），男，博士，副主任医师，主要研究方向为中医药治疗小儿脑病的研究。

马 融，E-mail:mr1974@163.com。

2015-04-26）

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