中药材中黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2 测定方法研究

李 浩

（广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021）

黄曲霉毒素是一种对人和动物均有极强毒性的剧毒物质，世界卫生组织（WHO）早在1993年就将其划定为Ⅰ类致癌物［1］，可诱发各种癌症［2-3］，也是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物，主要由黄曲霉、寄生曲霉等产生，目前已鉴定且明确结构的约有 17 种成分，最常见的有黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2，其中黄曲霉毒素B1含量最多，且毒性和致癌性均最强。近年来，黄曲

霉毒素污染广泛存在于中药生产、贮存、运输过程中的各个环节，故对中药材中黄曲霉毒素含量进行准确测定，对于保障用药安全有极其重要的意义［4-5］。目前，黄曲霉毒素常用的检测方法有高效液相色谱（HPLC）法、酶联免疫化学分析法、薄层色谱法、微柱筛选法、液-质谱联用法等［6-11］。本研究中采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱分离-串联三重四级杆质谱（HPLC-MS／MS）法测定中药材中的黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2，以探讨检测黄曲霉毒素更好的方法。

1 仪器与试药

安捷伦1200型高效液相色谱仪，配6410型三重四级杆串联质谱仪配有电喷雾离子化源（ESI源，美国安捷伦公司），数据由Masshunter工作站采集和分析；AE 240型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler公司）；旋转振荡器（江苏太仓市实验设备厂）；Z2064型离心机（德国Hermle公司）；Milli-Q超纯水处理系统；黄曲霉总量（B1，B2，G1，G2）免疫亲和层析柱（北京华安麦科生物技术有限公司）。黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，美国 Supelco 公司提供，编号 Lot：LB62461）；甲醇、乙腈均为色谱纯，美国J.T.Baker提供；乙酸铵为色谱纯，由美国Sigma公司提供；水为高纯水；药材样品均由本所购买。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及质谱条件

色谱条件：色谱柱为Agilent XDB-C18柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流动相为甲醇 -乙腈（3 ∶2）-0.1 mmol／L 乙酸铵，梯度洗脱条件见表1；流速为0.3mL／min；柱温为30℃；进样量为10μL；分析时间为10 min。

表1 流动相梯度洗脱条件

质谱条件：ESI离子源；扫描方式：正离子多反应监测（MRM）模式；喷雾器40 psi；喷雾电压4.0 kV；干燥气温度350℃；干燥气流速（N2）9 mL／min。为保护离子源，采用了分段扫描。质谱参数见表2，质谱图见图1。

表2 黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2检测离子对及相关参数

2.2 测定方法

精密量取黄曲霉毒素混合标准品0.5mL，用甲醇稀释至10mL，制成混合对照品贮备液。精密量取贮备液1 mL，置50 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至50 mL，制成混合对照品溶液。取中药材供试品粗粉末（约5 g），加入50 mL 70%甲醇溶液，震荡混匀20 min，然后以2 500 r／min的速率离心5 min，精密量取5 mL上清液于25 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至刻度，取经微孔滤膜（0.45 μm）的续滤液 20 mL，在 3 mL ／min 的流速下通过免疫亲合层析柱，加入超纯水20 mL分2次淋洗亲和层析柱；准确加入1.5 mL甲醇，分次洗脱免疫层析柱，洗脱液以超纯水稀释至2 mL，即得供试品溶液。精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱 - 串联质谱（LC-MS ／MS）仪进行测定，记录色谱图，通过计算、分析后即得。

2.3 方法学考察

检测限与定量限确定：将混合对照品溶液适当倍比稀释后，进样分析，以信噪比 S／N＝3∶1，10∶1分别确定定量限与检测限。以黄曲霉毒素B1计，检测限与定量限见表3。

表3 检测限与定量限确定

图 1 黄曲霉毒素 B1（A），B2（B），G1（C），G2（D）的二级全扫描质谱图及MRM总离子流图（E）

线性关系考察：将混合对照品溶液适当倍比稀释后，进样分析，测定峰面积积分值，回归分析后得相应标准曲线，见表4。结果表明，黄曲霉毒素G2和B2进样量在0.3～30 pg、黄曲霉毒素G1和B1进样量在1～100 pg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r＞0.999 0）。

精密度试验：取同一混合对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，测定各色谱峰的峰面积值，计算相对标准偏差（RSD）。结果黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2的 RSD 分别为 2.95% ，4.51% ，6.25%，5.42%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

表4 黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2线性关系考察结果

回收率试验：添加以黄曲霉毒素 B1计为 10，2，0.5 μg ／kg 的高、中、低3个质量浓度溶液。取中药供试品粗粉末5 g，各加入混合对照品贮备液（黄曲霉毒素 B1含量为 50 ng ／mL）5.00，1.00，0.25 mL，分别加70%甲醇溶液至50 mL，按拟订方法制备供试品溶液，然后按拟订色谱条件进样测定。结果见表5。

表 5 黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2加样回收试验结果（n＝9，%）

2.4 样品含量测定

按所建立的方法分别对生槟榔、生麦芽、炒槟榔、红花、炒牛蒡子、川牛膝、化橘红、柏子仁进行了黄曲霉毒素残留测定，结果见表6。

表6 样品含量测定结果（μg／kg）

3 讨论

按照免疫亲和柱-HPLC法制备供试品溶液时，最后的洗脱溶剂为甲醇，直接进样时，峰形较差。需将供试品溶液转化为流动相溶解才能改善峰形。故拟将供试品溶液在50℃下用氮气吹干，再用流动相进行定容。

样品前处理方法如使用含吐温的PBS进行淋洗，因吐温为表面活性剂，对质谱的离子化效率有影响，并且污染离子源，降低仪器的灵敏度。故样品前处理时对溶剂选择应加以考虑。

考虑到供试品基质的复杂多样性，减少杂质对待测组分的干扰，提高方法的适用性，通过更换不同类型色谱柱、调整流动相等进一步优化色谱分离条件，能在快速分析的同时提高分离度，避免杂质的干扰。

以目前的分析方法，黄曲霉毒素4个组分G2，G1，B2，B1的检测限分别为 0.06，0.08，0.04，0.04 μg ／kg，灵敏度优于 HPLC 法，已能满足目前的分析需要。

由于LC-MS／MS系统检测方法的通用性，可考虑目前建立的MS系统对其他主要真菌毒素的检测扩展，如赭曲霉毒素等［12］。

黄曲霉毒素的前处理方法采用的净化方式有免疫亲和柱净化［2］、Mycosep 多功能净化柱［3］等。LC-MS ／MS 系统由于其检测方法的通用性，在同一系统扩展检测毒素种类，则需考虑前处理方法的通用性，包括提取、净化方式等。

HPLC-MS／MS法可适用于较复杂基质样品中的多组分、低含量残留测定。与酶联免疫吸附法（ELISA），气相色谱法（GC），HPLC法等传统方法比较，HPLC-MS／MS法具有速度快、灵敏度高、选择性强、分析周期短、适用范围广、重复性好等优点［13-14］，是霉菌毒素检测的最佳确认方法。

参考文献：

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