剑麻斑马纹病菌5个多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析

吴伟怀　梁艳琼　郑金龙　习金根　郑肖兰　李锐　刘巧莲　张驰成　贺春萍　易克贤

摘 要 以寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg1～pppg5等5个基因cDNA序列为参考，设计基因编码区特异性引物。利用5对引物分别对剑麻斑马纹病菌进行分子检测以及基因同源克隆。通过此方法首次从剑麻斑马纹病菌中获得了5个多聚半乳糖醛酸酶基因，并分别命名为Szpg1～Szpg5。检测结果表明，Szpg1～Szpg5基因普遍存在于被检测剑麻斑马纹病菌中。序列分析结果表明，Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5对应基因之间存在核苷酸序列差异，由此导致个别氨基酸的差异，甚至提前终止。由此推测，Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5在功能上可能存在着一定的差异。

关键词 剑麻斑马纹病；多聚半乳糖醛酸酶；基因克隆

中图分类号 S432.4；Q78 文献标识码 A

Cloning and Sequence Analysis of Five Polygalacturonase

Genes of Phytophora nicotianae in Sisal

WU Weihuai1， LIANG Yanqiong1， ZHENG Jinlong1， XI Jingen1， ZHENG Xiaolan1，

LI Rui1， LIU Qiaolian2， ZHANG Chicheng3， HE Chunping1 *， YI Kexian1 *

1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control

of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical

Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

2 Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China

3 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan， 570228， China

Abstract Sisal zebra disease caused by Phytophora nicotianae var. parasitica is a kind of main diseases which cause serious damage to the sisal. In this study， five specific primer pairs were designed in coding region based on the reference sequence of pppg1 to pppg5 gene from Phytophora parasitica. Five specific primer pairs were used for the molecular detection and gene cloning from sisal zebra pathgoen DNA. This is the first time from sisal zebra isolating five polygalacturonase genes through this method， and respectively designated as Szpg1 to Szpg5. The detecting results showed that Szpg1 to Szpg5 genes were widely distributed in the sisal zebra isolates. Sequence analysis results showed that there were sequence differences between Szpg1 to Szpg5 and pppg1 to pppg5， respectively， leading to some amino acid differences， and even early termination. Thus it is speculated that Szpg1 to Szpg5 genes may exist a certain differences in function. This research would lay a solid foundation for the further study of sisal zebra germs polygalaturonase role in the pathogenic process.

Key words Sisal zebra disease； Polygalaturonase； Cloning

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.016

植物细胞壁是寄主与病原菌互作的重要场所，病原菌定殖于寄主表面后只有穿透细胞壁的屏障并与之建立了寄生关系，才能表现出致病性，在此过程中细胞壁降解酶发挥了极其重要的作用[1]。而由植物病原菌分泌的细胞壁降解酶主要包括多聚半乳糖醛酸酶（Polygalaturonase， PG）、果胶裂解酶、果胶甲基酯酶和β-半乳糖苷酶，其中PG在致病力和细胞壁降解酶中起着最为重要的作用[2]。已有研究结果表明，PG在植物病原菌侵染寄主过程中降解果胶，为病原菌顺利与寄主建立寄生关系奠定基础，是重要的致病因子之一。如当黄曲霉菌（Aspergillus flavus）内源多聚半乳糖醛酸酶基因pecA表达时，有利于病原菌在棉桃中的侵入与传播[3]。BcPG1（Botrytis cinerea polygalacturonase 1）基因突变后能导致灰葡萄菌（Botrytis cinerea）对寄主植物的毒性减弱[4]。而侵染柑橘果实的链格孢菌（Alternaria citri）的内切PG基因突变后在柑橘类与马铃薯组织中产生黑腐症状的能力明显地减弱[5]。与之相似，由突变而产生的内切PG基因活性丧失的麦角菌（Claviceps purpurea）突变菌株几乎对黑麦不致病[6]。

由烟草疫霉（Phytophora nicotianae var. parasitica或Phytophora parasitica var. nicotianae）引起的剑麻斑马纹病（Sisal zebra disease）是一种严重危害剑麻的主要病害。如遇高温多雨季节容易发生病害流行，造成植麻区麻田早期大量缺株，严重影响剑麻产业的发展。该病曾于1973年在我国暴发并流行，成为剑麻生产影响最大的病害。虽然该病目前得到了有效控制，但是在高温多雨季节仍可爆发成灾。前期，国内外对于剑麻斑马纹病菌的研究主要集中在该菌的致病性分化、生物学特性以及防治药剂等研究方面，而没有从PG这个关键的致病酶着手的研究报道。目前，已从寄生疫霉菌（Phytophora parasitica）中克隆了pppg1～pppg10共10个PG基因[7-8]。这为研究剑麻斑马纹病菌中的PG基因提供了方便。为此，本研究以这些基因序列为参考序列设计基因特异引物，对剑麻斑马纹病菌中PG基因进行了克隆（命名为Szpg）与测序；为下一步研究剑麻斑马纹病菌PG对剑麻致病过程中的作用奠定基础。本研究中即报道了Szpg1～Szpg5等5个基因的克隆与序列分析工作。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

本研究中用于分子检测的12个剑麻斑马纹病菌分别收集自广东、广西、海南等剑麻种植区。其中广东菌株8个，广西菌株2个，海南菌株2个。菌株现保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。其具体相关信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 菌丝体收集及DNA提取 利用马铃薯葡萄糖液体培养基对各供试菌株进行摇菌，28 ℃，160 r/min培养6 d 后，对菌丝体进行收集。收集的各菌丝体迅速于液氮中研磨，后进行基因组DNA提取。DNA提取采用DNA提取试剂盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit， Omega公司，美国）提取，具体实验步骤参考其说明书进行。

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成 在马铃薯葡萄糖液体培养基培养剑麻斑马纹病原菌菌株6 d后，收集菌丝体并立即进行总RNA提取。总RNA 抽提按TRIzol试剂盒（Gibco-BRL）操作方法进行。利用反转录试剂盒SuperscriptTM III Reverse Transcriptase （Invitrogen）进行cDNA的反转录合成。

1.2.3 引物设计 以寄生疫霉PG基因pppg1（AY697926）、pppg2（EU041943）、pppg3（EU041944）、pppg4（EU041945）、pppg5（EU041945）为参考序列[7-8]，利用软件primer5.0于各基因启始密码子位置设计正向引物，而于终止密码子处设计反向引物，使扩增产物包含完整的编码区。用于对gDNA与cDNA的扩增与克隆。设计引物参考下列原则：引物一般要求GC含量40%～65%，Tm值55～65 ℃，引物序列长18～25 bp，且无错配、不形成二聚体和发夹结构等。设计好的引物委托英骏生物技术有限公司合成。具体引物序列见表2。

1.2.4 PCR扩增及反应条件 基因组PCR反应体系为20 μL，含有20～30 ng DNA模板，10 μL 2×EcoTaq PCR SuperMix，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），最后以ddH2O补齐。PCR反应在 Mastercycler gradient Mastercycler PCR扩增仪上进行，扩增程序为：94 ℃预变性3 min；随后94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增35个循环；最后72℃延伸5 min，20 ℃保存。PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下照相并保存。cDNA PCR扩增参照基因组体系及条件，扩增所使用的高保真酶购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2.5 克隆与序列分析 以菌株ND-12 DNA为模板，分别回收各基因的gDNA与cDNA扩增子，各取4 μL与pEASYTM Cloning Vector连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选后，各选取3个阳性克隆送英骏生物技术有限公司测序。获得的序列经人工去除载体序列后，利用DNAStar software（www.DNAStar.com）进行序列拼接与相关分析。蛋白质序列相似性分析利用http：//www.uniprot.org/uniprot/？query网站完成；蛋白质的理论等电点（Theoretical isoelectric points， pI）和分子量（molecular weights， Mw）计算利用Compute pI/ Mw工具（www.expasy.ch/tools/pi_tool.html[9]）进行。

2 结果与分析

2.1 Szpg1～Szpg5基因分子检测

利用所设计的5个基因特异引物对，分别以剑麻斑马纹病菌菌株DNA为模板进行扩增。结果5对引物分别从12个供试菌株中均扩增出目标条带。具体而言，引物pppg1F/R从12个菌株中均扩增出特异条带，其大小位于1～2 kb之间（图1-A）；引物pppg2F/R和pppg3F/R也均从12个模板中扩增出目标条带，大小均与预期比较相似，约为1.1 kb（图1-B；Szpg2基因分子检测图未列出）；而引物pppg4F/R和引物pppg5F/R从12个供试菌株中扩增出1条比1 kb大的单一条带（图1-D）。由此表明，Szpg1～Szpg5基因在12个剑麻斑马纹病菌菌中是普遍存在的。

2.2 Szpg1～Szpg5基因编码区分析

利用5对引物分别扩增菌株ND-12的gDNA与cDNA。结果表明，5对引物均从cDNA与gDNA中扩增出条带，而且来自cDNA的与其对应gDNA的扩增子大小无明显差异（图2）。

2.3 Szpg1～Szpg5基因编码区序列分析及分子特征

对获得的各基因的cDNA序列与相应基因组序列作比较。序列分析结果表明，通过引物pppg1F/R获得了1 227 bp的序列，含有348、828 bp等2个外显子以及1个51 bp的内含子。ORF Finder 软件分析发现，完整ORF为1 176 bp，命名为Szpg1（依次类推）。推断基因产物由391个氨基酸残基组成，估计分子量为4.17 ku，等电点（pI）为5.57。与寄生疫霉PG基因pppg1的序列相比，Szpg1基因在编码区存在3个核苷酸差异，其中一个为非同义突变（图3-A），其氨基酸序列一致性水平为99%。

通过引物pppg2F/R获得了Szpg2基因1 155 bp序列，预测为1个连续完整的ORF，编码384个氨基酸，估计分子量为3.99 ku，等电点（pI）为9.17。与pppg2的序列相比，Szpg2基因编码区存在30多个核苷酸差异，最终导致24个氨基酸的差异，其氨基酸序列一致性水平为93%（图3-B）。

利用引物pppg3F/R获得了Szpg3 1 155 bp的基因序列，ORF Finder 软件分析发现为1个连续完整的ORF，编码384个氨基酸，估计分子量为3.98 ku，等电点（pI）为9.25。与pppg3的序列相比，Szpg3在编码区存在18个核苷酸差异，以及12个核苷酸插入。最终导致14个氨基酸的差异（图3-C），其氨基酸序列一致性水平为96%。

通过引物pppg4F/R获得了1 089 bp的Szpg4基因序列，为1个连续完整的ORF，编码362个氨基酸，估计分子量为3.73 ku，等电点（pI）为6.71。与pppg4的序列相比存在5个核苷酸差异，其中1个为非同义突变（图3-D），其氨基酸序列一致性水平为99%。

通过引物pppg5F/R获得了Szpg5基因1 083 bp的序列， 与pppg5的序列相比，Szpg5其核苷酸序列存在7个核苷酸的差异。值得一提的是，在第73位的核苷酸的突变（C73T），与第74及75位核苷酸AA，形成了一个终止子，导致提前终止。由此推测，该基因并不具有正常功能（数据未列出）。

总之，来自剑麻斑马纹病菌Szpg1至Szpg5基因中，除Szpg1中含有1个51 bp的内含子外，其余基因并无内含子。其编码区序列与寄生疫霉PG基因pppg1～pppg5对应基因之间存在核苷酸差异，尤其是Szpg2与Szpg3基因。此外，Szpg5基因由于单核苷酸的突变从而导致提前终止。

3 讨论与结论

近年来，国际上有关卵菌PG基因族的研究已有一些报道。目前，研究卵菌多聚半乳糖醛酸酶基因比较多的是樟疫霉（P. cinnamomi）与致病疫霉（P. infestans）和寄生疫霉（P. parasitica）。对于卵菌的第一个内切PG基因pipg1则是从马铃薯晚疫病菌致病疫霉分离到的，该基因编码的内切多聚半乳糖醛酸酶具有致病活性[10]。此外，对樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）致病菌PG基因家族的研究，发现受试致病性菌的PG基因家族组成较大，含有19个pg基因（Pcpg1～Pcpg19），其中除Pcpg5、Pcpg18、Pcpg13等3个基因外，其余的多个基因间具有明显的网络关系，并且发现关键pg基因编码的蛋白质一级结构的主要结构基团的修饰特性与PG致病活性密切相关[11]。而巩振辉等[12-14]又对其若干个pg基因的遗传转化进行了研究，发现pg基因均能指导合成相应的PG酶，并具有不同的活性。并同时发现其中编码该酶的具有不同程度糖基化的pg基因对该酶的致病性起着至关重要的作用。与之相似，寄生疫霉内切PG基因事实上是一个多基因家系，除了pppg1之外[7]，至少还包含pppg2～pppg10等9个基因[8]。

尽管目前已从多种病原菌中分离到了多聚半乳糖醛酸酶基因，但在剑麻斑马纹病菌中分离还未见报道。本研究利用同源克隆法首次对剑麻斑马纹病菌中细胞壁降解霉基因Szpg1～Szpg5的编码区进行了分子检测以及克隆及序列比较分析。通过本实验表明它们在剑麻斑马纹病菌中普遍存在，除Szpg5基因由于变异而提前终止外，其余Szpg1～Szpg4基因与寄生疫霉pppg1～pppg4对应基因序列具有高度的相似性，其氨基酸序列一致性均在90%以上。除此之外，基因之间也存在不少核苷酸变异，甚至有些是非同义突变，究其原因可能是病原菌为适应不同寄主、环境而进化的结果。事实上，在基因与寄主之间的共进化中，病原菌在面对寄主强大的选择压时，导致了病原包括基因点突变、基因缺失等多种变异[15-16]。

根据已有的表达实验表明，寄生疫霉基pppg2能导致本生烟明显的黄花与矮小；pppg4基因本生烟上产生矮化表型；而pppg5基因使本生烟产生银叶以及叶肉细胞严重变形[8]。在氨基酸水平上，来自剑麻斑马纹病菌Szpg1～Szpg4（Szpg5提前终止）与寄生疫霉基因pppg1～pppg4之间在存在一些差异。这些氨基酸的差异，是否导致功能上的变化还有待进一步研究。

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