一个巴西橡胶树过氧化物酶基因克隆与生物信息学分析

2014-11-24 19:35邓玉杰余海洋张宇王萌

热带农业工程 2014年4期

邓玉杰+余海洋+张宇+王萌

摘要采用分子生物学和生物信息学技术，在橡胶树热研7-33-97的叶片中扩增了一个过氧化物酶基因的全长cDNA，命名为HbPRX2。该基因全长1 179 bp，5端29 bp，3端145 bp，阅读框1 005 bp，编码335个氨基酸。推导的氨基酸理论分子量34.85 u，等电点4.98。推导的氨基酸含有过氧化物酶蛋白特征性的Peroxidase4结构域。HbPRX2蛋白与巴西橡胶树HbPRX1、HbPRX42、拟南芥AtPER42和水稻OsPRX33的过氧化物酶蛋白相似性分别为63.22 %、32.37 %、33.73 %和37.80 %。生物信息学分析表明，橡胶树HbPRX2蛋白定位于分泌途径中，属于亲水性蛋白，性质稳定，在7-24、36-55、130-151和278-301氨基酸处具有跨膜结构域，在29-30氨基酸处具有信号肽结构。本研究为深入研究HbPRX2基因的结构与功能及其抗逆机制奠定基础。

关键词巴西橡胶树；HbPRX2 ；生物信息学；基因克隆

中图分类号 S794.1

Cloning and Bioinformatic Analysis of a Peroxidase Gene in Rubber Tree（Hevea brasiliensis Muell. Arg）

DENG Yujie YU Haiyang ZHANG Yu WANG Meng

（Hainan University，Haikou，Hainan 570228）

Abstract Peroxidase is the enzyme of catalytic oxidation of substrates using hydrogen peroxide as electron acceptor. In this study，one peroxidase gene full length cDNA was amplified in the leaf in rubber tree clone CATAS7-33-97，designated as HbPRX2， It was 1 179 bp in length，containing a 1 005 bp ORF which encodes 335 amino acid residues，a 145 bp 3'untranslation region and a 29 bp 5'untranslation region. The molecular mass of the putative protein is 34.85 kDa with its theoretical pI of 4.98. The deduced amino acid sequence had the specific domains of plant peroxidase like super-family domain peroxidase4. It shares 63.22%，32.37%，33.73% and 37.80% identities with Hevea brasiliensis HbPRX1，HbPRX42，Arabidopsis AtPER42 and rice OsPRX33，respectively. The bioinformatic analysis showed that HbPRX2 protein is a hydrophilous protein which have an secretion pathway signal. It was a stable protein with transmembrane region at 7-24，36-55，130-151，and 278-301 amino acid and signal Peptide at 29-30 amino acid， respectively. This study provides a fundamental knowledge of further study the structure and functions of HbPRX2.

Key words Hevea brasiliensis ；HbPRX2 ；bioinformatics ；gene cloning

ClassIII型过氧化物酶（Peorxidaes，EC1.11.1.7）是一类以血红素为辅基的酶，在生物中广泛存在，具有多种不同的生物功能[1-2]，主要催化过氧化氢对多种有机物和无机物的氧化作用，包括酚类、生长素、木质素前体和次生代谢产物[3-4]。它是多基因家族成员，在水稻中有138个成员[5]，在拟南芥有73个成员[6]，同时它也是糖蛋白，位于植物液泡和细胞壁中[7]。过氧化物酶蛋白的分子量约为30-45 ku，由大概300个氨基酸残基组成，其中存在酸碱催化域和血红素结合区域[常含8个半胱氨酸（构成4个二硫键桥）]，2个钙离子结合区，在ASp99和Argl23还有一个盐桥，2-6个糖基化位点，一个原高铁血红素。目前，除了水稻和拟南芥等模式植物外[8-10]，已在甘蔗[11]、大豆[12]中克隆了过氧化酶基因。巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是天然橡胶的主要来源，橡胶树的乙烯利刺激割制[13]、病原菌侵害和环境危害[14]等都会引起橡胶树胶乳活性氧的产生，导致黄色体破裂。过氧化物酶作为活性分子的主要生物淬灭剂，有助于保护橡胶树免受活性氧的危害。因此，克隆巴西橡胶树胶乳中的过氧化物酶基因并研究其结构和功能对天然橡胶产业的良性发展具有重要的理论价值和实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

以定植在海南大学农学院教学基地的巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97的叶片为材料。

1.1.2 质粒、菌种和试剂盒

克隆载体pMD18-T Vector、大肠杆菌DH5α感受态、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶等购自中国大连Takara公司；凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR Master Mix，pfu Master Mix等均购自天根生化科技（北京）有限公司；反转录试剂盒购自美国Fermentas公司；其他生化试剂和常规试剂均为国产分析纯；所有引物合成及测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 叶片RNA的提取

RNA提取参照马瑞丰等[15]的方法。RNA质量检测：取1 μL RNA样品用RNase-Free ddH2O稀释至500 μL，用紫外分光光度计测定其OD230、OD260、OD280的吸收值，并根据OD260/OD230、OD260/OD280计算总RNA溶液的浓度及纯度。用甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.2.2 反转录

用RNA反转录试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas）进行反转录。在0.2 mL的Eppendorf管中依次加入总RNA 1 μL，QT引物1 μL，以1 ‰ DEPC处理水补足12 μL，混匀，瞬时离心；随后于70 ℃中孵育5 min，冰上冷却，瞬时离心；依次加入5×reaction buffer 4 μL，RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor（20 u/μL）1 μL，10 mmol/L dNTP mix 2 μL，轻轻混匀，瞬时离心；在37 ℃中孵育5 min；随后加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase（200 u/μL）1 μL，于42 ℃中孵育60 min；最后以70 ℃加热10 min终止反应，冰上冷却，稀释5倍，于-20 ℃保存。

1.2.3 橡胶树叶片过氧化物酶基因序列的克隆

根据在NCBI上搜索的橡胶树EST序列，设计过氧化物酶基因特异引物（表1）。

在0.2 mL的离心管中分别加入以下成分：反转录液1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，PrxS1或PrxS2 1 μL，PrxA1或PrxA2 1 μL，ddH2O 7 μL，总体积20 μL。混匀后，在DNA Thermo Cycler T1上进行PCR反应，反应程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的片段，用凝胶回收纯化试剂盒回收并克隆至pMD18-T载体，送交测序。

1.2.4 基因结构生物信息学分析

采用DNAMAN7.0软件进行DNA和蛋白序列比对，用DNAstar软件进行ORF筛选，用NCBI Blast软件和PROSITE软件进行结构域分析，用ProtParam分析理化性质，用ProtScale分析亲水性，用SignalP分析信号肽，用TMpred和TMHMM分析跨膜结构域，用PSORT、Mitoprot和TargetP分析细胞定位。

2 结果与分析

2.1 RNA的提取

甲醛变性凝胶电泳结果发现，28S rRNA、18S rRNA分带清晰，且28S rRNA的量约是18S rRNA的2倍，说明所提取的总RNA完整性好，几乎无降解（图1-A）。取1 μL橡胶树叶片总RNA稀释至500 μL后进行紫外分光光度计检测，其OD260/OD280为2.06，表明RNA样品几乎没有蛋白质污染，而OD260/OD230为2.1，表明几乎没有酚和多糖类物质的污染，符合下一步反转录和基因扩增要求。

以反转录的cDNA为模板，利用特异引物进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增出了约1 200 bp的条带（图1-B），与预测片段大小基本一致。将扩增的DNA片段回收后，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选重组子进行测序。测序结果表明所克隆的cDNA全长1 179 bp，命名为HbPRX2。

2.2 HbPRX2序列分析

HbPRX2基因全长1 179 bp，5端29 bp，3端145 bp，阅读框1 005 bp，编码335个氨基酸。推导的氨基酸理论分子量为34.85 u，等电点为4.98（图2）。分子式为C1513H2394N420O500S12，总原子数4 839。图3和表2是根据橡胶树HbPRX2的cDNA序列推导的氨基酸序列与其他植物中的过氧化物酶基因所编码的蛋白质氨基酸序列相似性比较结果。从中可以看出，HbPRX2推导的氨基酸含有HbPRX2蛋白特征性的PEROXIDASE_4结构域。HbPRX2基因与巴西橡胶树HbPRX1、HbPRX42、拟南芥AtPER42和水稻的OsPRX33的过氧化物酶蛋白序列相似性分别为63.22 %、32.37 %、33.73 %和37.80 %。

2.3 HbPRX2生物信息学分析

2.3.1 HbPRX2蛋白结构域功能分析

植物的过氧化物酶大多含有一个特征性结构域：PEROXIDASE_4， PS50873。Class III型过氧化物酶位于细胞外空间或者植物的液泡中，参与过氧化氢的解毒活动、生长素代谢、木质素生物合成和胁迫反应，含有4个保守的二硫化物桥和2个保守的钙离子结合位点。从图4可以看出HbPRX2蛋白具有特征性PEROXIDASE_4结构域，并与其它过氧化物酶成员高度保守，属于过氧化物酶家族成员（图4）。

2.3.2 HbPRX2蛋白的信号肽分析

根据SignalP-4.1工具在线分析结果，HbPRX2蛋白在29-30氨基酸处具有一个信号肽结构（图5）。

2.3.3 HbPRX2蛋白的亲水性分析

利用ProtScale预测巴西橡胶树HbPRX2蛋白氨基酸序列的亲水性/疏水性（图6）。依据氨基酸分值越低亲水性越强、分值越高疏水性越强的规律，可以看出，多肽链第20位具有最高的分值3.600和最强的疏水性；第257位具有最低的分值-1.733和最强的亲水性。橡胶树HbPRX2的整条多肽链表现为亲水性。

2.3.4 HbPRX2蛋白的跨膜结构域分析

根据TMHMM和TMpred网站分析，超过500分的才被认为显著。从图7中可以看出HbPRX2蛋白有4个跨膜螺旋，分别位于7-24、36-55、130-151和278-301氨基酸残基处，分数为3812，达到500分的显著值，故可推测HbPRX2含有跨膜结构域（图7）。

2.3.5 HbPRX2蛋白的细胞定位分析

根据TargetP 1.1分析， HbPRX2蛋白在叶绿体中的可能性为0.018，在分泌信号途径中的可能性为0.905，在其他部位的可能性为0.009（表3），推测该蛋白含有信号肽，属于分泌信号途径，可靠性级别为1；经Mitoprot分析可知，其在线粒体外的几率为0.4163；运用PSORT分析细胞定位，证明其在外部的确定性为0.82，在溶酶体和内质网的确定性为0.100（表4）。

3 讨论与结论

血红素结合的过氧化物酶（EC1.11.1.）用过氧化氢作为电子受体实行各种合成和降解功能[10]。血红素过氧化物酶广泛分布于细菌、真菌、植物和脊椎动物中。根据结构特性，它们可划分为植物和动物2个大型超家族。植物过氧化物酶超家族可分为3类：第I类是原核来源的过氧化物酶，包括植物抗坏血酸过氧化物酶，它们在高等植物叶绿体和细胞质的过氧化氢去除过程中发挥了关键作用，如酵母细胞色素c过氧化物酶（EC1.11.1.5）；第II类是分泌真菌过氧化物酶——真菌木质酶，木质酶催化降解木质素的第一步是通过催化C（α）C（β）丙基侧链裂解木质素；第III类是经典分泌植物过氧化物酶——植物过氧化物酶（EC1.11.1.7）。植物中含有大量的过氧化物酶同工酶，其中一些在细胞栓化过程中起着催化细胞壁上的木栓质芳香残留沉积的作用，有些是参与伤信号的防御反应，其他都参与生长素的代谢和木质素的生物合成[16-17]。

在橡胶树愈伤组织中也检测到了过氧化物酶[18]，并在橡胶树树皮中克隆了一个50 ku的过氧化物酶[19]，在细胞悬浮液中通过生化方法鉴定了一个过氧化物酶[20]。本研究中，笔者发现HbPRX2蛋白与巴西橡胶树HbPRX1、HbPRX42、拟南芥AtPER42和水稻的OsPRX33的过氧化物酶蛋白相似性分别为63.22 %、32.37 %、33.73 %和37.80 %。

植物的过氧化物酶大多含有一个特征性结构域：PEROXIDASE_4， PS50873。所有的过氧化物酶都有非朊基血红素基团，以过氧化氢为受体参与多种氧化反应[21-22]。HbPRX2蛋白具有特征性PEROXIDASE_4结构域，并与其它过氧化物酶成员高度保守，属于过氧化物酶家族成员。生物信息学分析表明，橡胶树HbPRX2蛋白定位于分泌途径中，属于亲水性蛋白，性质稳定，在7-24、36-55、130-151和278-301氨基酸处具有跨膜结构域，在29-30氨基酸处具有信号肽结构。可为下一步深入研究其功能及原核表达、亚细胞定位等提供参考。

从橡胶树中克隆了橡胶树过氧化物酶基因HbPRX2，其含有特征性的过氧化物酶结构域，为深入研究HbPRX2的结构与功能奠定基础。

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